寧夏甜瓜酒優良酵母菌的篩選及鑒定

張春芝，莫寅斌，江志國，章洋

（寧夏葡萄酒與防沙治沙職業技術學院，寧夏銀川750199）

甜瓜（Cucumis melo L.）又稱洋香瓜，香瓜等，屬葫蘆科甜瓜屬，是一種世界性的重要水果。其果實汁多而味甜，具有濃郁的香氣，并含有大量人體所需的葡萄糖、維生素、有機酸及礦物質；據測定，甜瓜果實干物質含量6%～18.5%，其中總糖含量為4.6%～15.8%（包括葡萄糖2%～3.6%，果糖0.5%～3.6%，蔗糖1%～11.2%）；果酸0.054%～0.128%；果膠0.8%～4.5%；纖維素和半纖維素2.6%～6.7%；而且每100克甜瓜中含有維生素C 29 mg～39.1 mg。寧夏得天獨厚的光熱資源和區位優勢，甜瓜產業得到了快速發展，已經成為寧夏中部干旱帶的優勢特色農業產業。同時也為生產甜瓜酒，豐富酒類產品品種，提高產品的高附加值，奠定了扎實的物質基礎[1-2]。

酵母菌是甜瓜酒釀造過程中最重要的微生物，它不但影響發酵速度，也影響著甜瓜酒的品質和風格[3-5]。生產甜瓜酒一般都是利用商業酵母作為發酵菌株[6-7]，而選擇利用來源于甜瓜的酵母進行甜瓜酒發酵報道不多[8-9]。本研究以自然發酵的甜瓜汁作為分離源進行酵母菌的分離、純化與鑒定，得到適合釀造甜瓜酒的酵母菌株NT13。并對其釀酒特性進行探索研究，為進一步開展甜瓜酒的應用和開發研究提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 樣品

選擇成熟度好的寧夏黃甜瓜，購自銀川市農貿市場。

1.1.2 培養基

酵母膏胨葡萄糖(YPD）培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體培養基加入瓊脂粉20 g/L）。

WL營養瓊脂培養基：酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸鎂0.012 5%、硫酸錳0.000 25%、溴甲酚綠0.002 2%、瓊脂2%，pH 6.5；121℃滅菌20 min。

氯化三苯基四氮唑（TTC）培養基[10]：由上層培養基與下層培養基組成。其中TTC上層培養基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現配現用；TTC下層培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。

甜瓜汁培養基：以甜瓜為原料制備的清汁，糖度為 18°Brix，100℃滅菌 10 min。

1.2 儀器與設備

T6新悅-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；H.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；pHS-3C酸度計：上海虹益儀器廠；手持糖度計：上海米青科實業有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面潔凈工作臺：蘇潔凈化設備有限公司；DYCP-31DN DNA電泳槽：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems公司；HC-2518R冷凍高速離心機：BBI公司；SP10-1000 Surf系列精密單道可調移液器：上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離

取新鮮成熟度好的甜瓜，帶皮剁碎，稱取100 g裝入500 mL無菌三角瓶中，用無菌紗布蓋住瓶口，28℃培養2 d～3 d，待發酵醪液出現發泡現象后即可分離。將上述發酵醪液適當稀釋，取0.2 mL涂布于YPD培養基上，每個梯度做3個平行，28℃培養2 d～3 d。長出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落采用劃線分離法進一步純化。將純化后的酵母菌種置于4℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的初篩

將分離純化后的酵母菌株以劃線分離的方式接種到WL營養培養基進行釀酒酵母的篩選，置于28℃恒溫培養箱中培養3 d～5 d后，觀察菌落特征。

1.3.3 酵母菌的復篩

一級復篩：TTC顯色法對初篩得到的酵母菌株的產酒精能力進行測定[11]。挑取紅色菌落進行二級篩選。

二級復篩：利用杜氏管發酵法[12]，在同等條件下，將一級篩選得到的菌株進行活化，以10%的接種量接入附有杜氏小管的甜瓜汁培養基中，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養48 h，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管中產氣情況。選取起酵速度快且發酵能力強的菌株進入三級篩選。

三級復篩：將二級篩選的菌株繼續培養1 d，由5位有品嘗經驗的教師組成的品評小組對發酵液進行感官評定酒的風味（色澤、香氣等）。

1.3.4 菌株的生理生化特性試驗

1.3.4.1 糖發酵鑒定[13]

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、棉子糖進行糖發酵試驗，菌株作3個重復。

1.3.4.2 同化碳源試驗[13]

分別用D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-木糖、纖維二糖、海藻糖、D-核糖、檸檬酸、乳糖、L-鼠李糖、肌醇、D-甘露糖、山梨醇、菊糖代替YPD培養基中的葡萄糖，菌株作3個重復。

1.3.5 菌株耐受性測定[14-15]

采用杜氏管發酵法，將篩選得到的菌株活化后分別以5%的接種量接種到不同含糖量（250、280、310、340、370、400、420 g/L）、不同乙醇含量（10%、12%、14%、15%、16%、17%和18%）、不同pH值（3.73、3.37、3.08、2.96、2.87、2.80 和 2.74）、不同 SO2濃度（120、160、200、230、250、280、300 mg/L） 的 10 mL 附有杜氏小管的滅菌甜瓜汁中，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養3 d，觀察杜氏小管中氣體的高度，以未做處理的甜瓜汁培養基作對照。

1.3.6 酵母菌性質實驗

1.3.6.1 菌株的產乙醇能力

甜瓜汁發酵法：將篩選得到的酵母菌株活化，以6%的接種量接種到200 mL滅菌甜瓜汁中，于25℃恒溫培養箱中靜置培養5 d，采用密度瓶法測定其乙醇體積分數[16]。

1.3.6.2 菌株的生長曲線測定[17]

將篩選得到的酵母菌株接種到滅菌的YPD液體培養基中，于25℃恒溫培養箱中靜置培養48 h，觀察菌株的生產情況，前期間隔2 h取樣，后期間隔12 h取樣，用可見分光光度計在560 nm波長處測定吸光度，重復3次，繪制菌株的生長曲線。

1.3.7 酵母菌的分子生物學鑒定

采用26S rDNA D1/D2區序列分析對篩選出的酵母菌株進行分子生物學鑒定[17]。將菌株平板送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測定的基因序列與GenBank數據庫中區域序列進行BLAST比對，分析該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離

經初步分離，共得到56株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，分別記號為NT1～NT56。

2.2 酵母菌的初篩

通過WL營養瓊脂培養基的初步篩選，挑取菌落顏色為奶油色至綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀的單菌落，共篩選出23株。

2.3 酵母菌的復篩

2.3.1 一級篩選

通過TTC顯色反應篩選出9株菌落顏色為紅色或深紅色的菌株 （圖 1），分別為 NT4、NT6、NT11、NT13、NT17、NT29、NT34、NT42、NT45，說明產酒精能力強。

圖1 TTC顯色反應結果Fig.1 Yeast strain cultured in TTC chromogenic medium

2.3.2 二級篩選

將9株一級篩選的菌株接種到附有杜氏小管的甜瓜汁培養基中，置于28℃恒溫培養箱中靜置培養48 h，觀察產氣情況，結果見表1。

表1 酵母菌的杜氏小管產氣情況Table 1 The produce gas of 9 yeast strains

由表1可知，有5株酵母產氣充滿杜氏小管，并能聞到淡淡的酒香，說明這些菌株具有較強的起酵能力和發酵力。

2.3.3 三級篩選

將5株二級篩選的菌株繼續培養1 d，進行感官評定，結果見表2。

表2 5株酵母菌株發酵甜瓜酒的感官評定Table 2 The sensory evaluation of 5 yeast strains fermented melon wine

經過綜合評定，NT13菌株發酵的甜瓜酒，色澤金黃，酒香濃郁，果香典型性強，適合作為甜瓜酒發酵菌種。

2.4 菌株生理生化鑒定

將NT13菌株進行進一步生理生化鑒定，結果見表3。

表3 酵母NT13菌株利用碳源試驗Table 3 The carbon sources tested of NT13

根據表3的試驗結果，對比《真菌鑒定手冊》初步判斷NT13菌株為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.5 NT13菌株耐受性測定

2.5.1 耐糖量測定

試管中加入10 mL完全溶解的不同糖濃度的甜瓜汁培養基，滅菌后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表4。

由表4可知，NT13菌株在含糖量為40%左右，可以良好地生長，且香氣較好，符合果酒酵母的要求。

表4 NT13菌株在不同糖濃度下的生長情況Table 4 The effects of different sugar content to NT13

2.5.2 耐酒精測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養基，滅菌冷卻后分別加入食用酒精，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表5。

表5 NT13菌株在不同乙醇體積分數下的生長情況Table 5 The effects of different alcohol content to NT13

由表5可知，NT13菌株可以耐受17%vol的乙醇，符合一般發酵果酒10%vol～14%vol的乙醇含量的要求。

2.5.3 耐pH值測定

試管中加入10 mL以檸檬酸調整pH值后的甜瓜汁培養基，滅菌冷卻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表6。

表6 NT13菌株在不同pH值下的生長情況Table 6 The effects of different pH to NT13

由表6可知，NT13菌株能夠在pH2.74的條件下存活，說明其耐酸能力可以達到果酒釀造要求。

2.5.4 耐SO2測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養基，滅菌冷卻后分別加入亞硫酸，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表7。

表7 NT13菌株在不同質量濃度SO2下的生長情況Table 7 The effects of different SO2concentrations to NT13

表7可知，NT13菌株有較強的SO2耐受能力，符合國標中對于果酒中SO2的最大殘留量250 mg/L的要求。試驗證明其在250 mg/L的條件下依然有較好的香氣。

2.6 NT13菌株性質試驗

2.6.1 產乙醇能力

根據GB 5009.225-2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》酒精度的測定方法，采用第一法即密度瓶法進行測定，結果見表8。

表8 NT13菌株產乙醇能力Table 8 The ethanol yield of NT13

將試驗結果代入計算公式，查附錄A后可得出NT13菌株產乙醇約為10.9%vol。

2.6.2 生長曲線測定

NT13菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可見，培養2 h后NT13菌株大量生長繁殖，菌量以指數級增加，10 h后達到最高值，之后趨于穩定。這與文獻有關酵母生長曲線的報道一致[18]。

2.7 NT13菌株的分子生物學鑒定

2.7.1 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區鑒定結果

NT13菌株PCR產物瓊脂糖電泳圖見圖3，NT13菌株的26S rDNA D1/D2區鑒定結果見表9。

圖2 NT13菌株的生長曲線Fig.2 The microbial growth curve of yeast NT13

圖3 NT13菌株PCR產物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR products by agaros electrophoresis of yeast NT13

表9 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區鑒定結果Table 9 Identification result based on 26S rDNA D1/D2 of NT13

如圖3所示，NT13菌株的26S rDNA序列長度為594 bp。經基因測序，在NCBI網站上進行BLAST序列比對（表9），結果表明NT13與酵母屬釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae相似性為100%，故將其鑒定為酵母屬釀酒酵母。

3 結論

本試驗從寧夏黃甜瓜自然發酵醪中分離篩選出1株優良酵母菌，該菌株產酒精能力和發酵能力強。經感官鑒定，產果香酒香濃郁，典型性強。耐受實驗結果表明其能夠耐受40%的含糖量、18%的乙醇和300 mg/L的SO2含量，能夠在pH2.74的酸性條件下良好生長。通過密度瓶法測其能夠自然發酵產乙醇約為10.9%vol，生長曲線測定實驗表明菌量在2 h后以指數級增加，10 h后趨于穩定。經生理生化鑒定及26S rDNA D1/D2鑒定為酵母屬釀酒酵母。以上試驗結果表明，NT13菌株符合一般果酒發酵的要求，可以應用于甜瓜酒的釀造。但有關該酵母菌的發酵工藝特性還有待于進一步研究。

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