賴氨酸誘導低離子強度下羅非魚肌球蛋白增溶及機制

朱潘紅，周春霞*，付葦婭，齊慧紅，李 婷，洪鵬志

肌球蛋白是肌肉蛋白的重要組成部分[1]，同時也是具有重要生物學功能的鹽溶性蛋白質[2-3]。通常認為肌球蛋白只在高離子強度條件下溶解，在體外高鹽溶液（如600 mmol/L KCl）中，分子間靜電相互作用被破壞，分子以單體或可溶性寡聚體形式存在，溶解度較高，而在體外低鹽溶液（＜200 mmol/L）中，肌球蛋白聚集成纖絲，呈不溶狀態，由此限制了肌球蛋白的加工特性[4-5]。研究發現氨基酸處理可以改善肌球蛋白的溶解度[6]。早在1994年，Stefansson等[7]就證明了90%的肌球蛋白可溶于含有組氨酸的低離子溶液中。隨后有學者發現使用含有組氨酸的緩沖液可以顯著提高低離子強度條件下雞胸肉肌球蛋白的溶解度[8]。在豬肌球蛋白增溶作用的研究中發現，50 mmol/L的精氨酸處理對其溶解度的影響較大且對分子的二級結構沒有影響[9]，精氨酸可以提高溶菌酶等蛋白質的復性率，并使豬肌球蛋白在低鹽離子強度下溶解。近些年研究發現賴氨酸還可以顯著提高豬肉肌球蛋白的溶解性[5,10]，肌球蛋白經賴氨酸處理后，其表面疏水性和活性巰基含量顯著增大，α-螺旋含量降低，而β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量增加，賴氨酸破壞了肌球蛋白的二級結構[11]，肌球蛋白的溶解度增加可能是由結構的改變而引起。但Takai等[9]的研究表明，賴氨酸在增大蛋白溶解度的同時不會影響肌球蛋白的二級結構。賴氨酸是堿性氨基酸，可能是通過靜電作用達到增溶效果，由于電荷的作用擾亂了肌球蛋白分子內部的作用，低離子強度下肌球蛋白絲狀體解離，進而蛋白溶解度增加。然而，目前有關賴氨酸增溶的機理還未完全明了[12]。因此，以羅非魚肌球蛋白為原料，在不同離子強度（1～150 mmol/L KCl）條件下，研究賴氨酸對肌球蛋白體系濁度、溶解度、分子結構和形態的影響，探討賴氨酸誘導肌球蛋白的增溶效果及機理，從而為羅非魚資源的深加工提供理論依據，進而擴大水產蛋白的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的羅非魚購買于湛江市工農市場，體長30 cm，體質量1 kg，立即帶回實驗室，宰殺取其白肉部分切小塊攪碎，并于4 ℃冰箱中保存備用。

三羥基甲基氨基甲烷（tris-(hydroxymethyl)-aminomethane，Tris） 廣州化學試劑廠；馬來酸（maleic acid，MA） 廣州齊云生物科技有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26sxp高速冷凍離心機 美國Beckman公司；UV757紫外-可見分光光度計 上海精科實業有限公司；Chirascan圓二色譜（circular dichroism，CD）儀英國應用光物理公司；JEM-1400透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子公司；Nano-2s MPT-2納米粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；RF-5301P熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白的提取主要參照Stafford等[13]的方法并稍加改動，在4 ℃條件下進行實驗，實驗中所使用的溶液均為4 ℃。取新鮮攪碎的魚肉500 g，按質量添加5 倍體積緩沖液A（20 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）），20 000 r/min高速勻漿30 s，浸提15 min后離心（5 500×g，10 min），取沉淀重復上述過程2 次。向所得沉淀中按質量加入3倍體積溶液B（0.45 mol/L KCl、5 mmol/L 5-腺苷三磷酸二鈉鹽（adenosine 5’-triphosphate disodium salt，5’-ATP）、7.5 mmol/L MgCl2、0.15 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），pH 6.4），攪拌15 min后離心（10 000×g，15 min）。上清液用4 層紗布過濾，濾液用9 倍體積4 ℃蒸餾水稀釋，靜置10 min后離心（10 000×g，10 min）得沉淀。向沉淀中按質量加入1/5體積緩沖液C（0.12 mol/L Tris-MA、3 mol/L KCl、0.6 mmol/L DTT，pH 7.5），混勻后放置2 h，混合體系中按質量加入1/10體積溶液D（0.11 mol/L ATP、55 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid，EGTA），pH 7.5）溶液后，攪拌1 h。加入硫酸銨至飽和度為40%時離心（10 000×g，15 min）取上清液，繼續加硫酸銨至飽和度為45%時離心（10 000×g，15 min）取沉淀。沉淀溶于透析液E（20 mmol/L Tris-HCl、0.6 mol/L KCl、0.1 mmol/L DTT，pH 7.0）中透析至無SO42-檢出，然后離心（50 000×g，60 min），所得上清液即為肌球蛋白溶液。

采用Lowry法[14]檢測上清液蛋白質含量，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準物，測定波長為750 nm。

1.3.2 樣品的制備

提取所得肌球蛋白用不同離子強度的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，KCl濃度分別為1、20、40、60、100、150、600 mmol/L，pH 7.0）透析24 h，然后測定蛋白質量濃度，用對應緩沖液將其稀釋至2.0 mg/mL，所得即為不同離子強度下肌球蛋白溶液。

不同離子強度的蛋白溶液分成3 份，分別進行以下處理：1）對照組：未經處理組；2）賴氨酸處理組：將稀釋好的蛋白溶液取出50 mL，用5 mmol/L賴氨酸透析24 h，所有的操作都在4 ℃下進行。透析后取出，4 ℃保存備用；3）酸堿處理組：將不同離子強度下的肌球蛋白pH值調節至同賴氨酸處理后肌球蛋白相同的pH值。KCl濃度為1、20、40、60、100、150、600 mmol/L時，相對應溶液的pH值分別為7.73、7.79、7.82、7.85、7.86、7.90。

1.3.3 濁度的測定

濁度的測定參Liu Ru等[15]的方法并稍加修改，取適量處理后的樣液（2.0 mg/mL），放置于室溫，用紫外-可見分光光度計，在波長200～800 nm處進行掃描，取370 nm波長處蛋白質溶液的吸光度為蛋白質樣品的濁度，用A370nm表示。每個樣品測定3 次。

1.3.4 溶解度的測定

將處理后的肌球蛋白溶液離心（50 000×g，15 min，4 ℃）取上清液，采用Lowry法[14]測定其蛋白質的質量濃度。肌球蛋白的溶解度按式（1）計算。每個樣品重復3 次。

1.3.5 表面疏水性的測定

采用8-苯胺基萘-1-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法[16]檢測可溶性蛋白表面疏水性。將離心后的可溶性肌球蛋白溶液梯度稀釋（0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.0 625 mg/mL），取不同質量濃度的溶液各4 mL，加入20 μL的ANS溶液（8.0 mmol/L ANS、0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.0），振蕩混勻，靜置10 min（避光），使用熒光分光光度計測定樣品的熒光強度。本實驗中，所用的激發波長和發射波長分別為374 nm和485 nm，狹縫寬為5 nm。將添加探針的樣品熒光強度值減去對應樣品的內源熒光強度值即為蛋白質的相對熒光強度。以相對熒光強度對蛋白質含量作圖，其初始段的斜率作為蛋白質的表面疏水性。每個樣品重復3 次。

1.3.6 二級結構的分析

CD的測定參照Ogawa等[17]的方法，取處理后的肌球蛋白溶液，用對應緩沖液稀釋至100 μg/mL，進行CD掃描。波長掃描范圍為190～260 nm，樣品池光徑為1 mm，上樣量為0.3 mL，測量溫度為4 ℃，測定分辨率為0.5 mm，掃描速率為100 nm/min，靈敏度為20 mdeg，響應時間為0.25 s，以緩沖液做空白，實驗值為3 次掃描的平均值，α-螺旋結構含量的計算如式（2）、（3）所示。

式中：[θ]222為2 2 2 n m波長處的摩爾橢圓率/（deg·cm2/dmol）；[θ]obs為222 nm波長處的橢圓率/mdeg；Mw為肌球蛋白的平均殘基分子質量，取115 g/mol[18]；ρ為肌球蛋白質量濃度/（mg/mL）；L為比色皿光程長度/mm。

1.3.7 Zeta-電位的測定

Zeta-電位的測定參考施小迪等[19]的方法，采用納米粒度分析儀，利用動態光散射技術，He-Ne激光在633 nm波長處對熱處理前后羅非魚肌球蛋白溶液（1 mg/mL）的電位進行測定，采用90°散射角對樣品進行除塵。經過處理的樣品注入毛細血管樣品池中，在室溫下穩定120 s后進行測試。每個樣品重復3 次。

1.3.8 TEM分析

樣品處理方法參考Hayakawa等[20]的方法，將經過處理的肌球蛋白溶液稀釋至0.25 mg/mL，滴1 滴于銅網格上固定，吸附后沖洗數次，再以體積分數0.5%～1.0%醋酸雙氧鈾染色。烘干后即可觀察樣品。

1.4 統計分析

利用JMP 7.0軟件進行方差分析，差異顯著性分析使用多重比較，P＜0.05表示存在顯著性差異。采用Origin 7.5軟件對各指標的變化趨勢進行作圖。

2 結果與分析

2.1 賴氨酸對低離子強度下肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響

賴氨酸對肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響見圖1，未經氨基酸透析處理及未經酸堿處理組，隨著離子強度的增大，體系濁度降低，表明溶解度增大。這是因為高鹽濃度下肌球蛋白以單體或寡聚體的形式存在，處于可溶狀態，溶解度高，濁度較小；在低鹽（KCl濃度不大于150 mmol/L）條件下，肌球蛋白分子聚集成纖絲，體系濁度較大，隨著鹽濃度的增大，靜電相互作用增強可能導致肌球蛋白絲狀體解離[8]，體系濁度顯著減小（P＜0.05），溶解度增大。經賴氨酸透析處理后，肌球蛋白體系濁度顯著降低，溶解度升高（P＜0.05），說明賴氨酸增溶效果明顯。研究發現組氨酸能誘導低離子強度（1 mmol/L KCl）下的肌球蛋白絲狀體發生解體，體系濁度降低，溶解度升高；而在生理離子強度（150 mmol/L KCl）下，肌球蛋白絲狀體依然存在[8]，因而濁度和溶解度均未發生顯著變化。賴氨酸是堿性氨基酸，誘導體系pH值改變，肌球蛋白分子間的靜電相互作用增強，溶解度增大。賴氨酸的添加可以拉長輕鏈肌球蛋白的頭部區域，造成肌球蛋白纖絲弱化，使肌球蛋白在低離子強度溶液中解離[10]。但與對應酸堿（0～20 mmol/L KCl）調節組比較，賴氨酸處理組增溶效果更明顯，由此表明賴氨酸誘導低離子強度下肌球蛋白體系增溶的機理不僅與靜電相互作用有關，可能還與肌球蛋白分子結構變化等有關。KCl濃度為40 mmol/L及以上時，隨著離子強度增大，賴氨酸處理組肌球蛋白的溶解度變化不顯著，這與Takai等[9]的研究結果基本一致。

圖1 低離子強度下賴氨酸對羅非魚肌球蛋白體系濁度（A）和溶解度（B）的影響Fig. 1 Effect of L-lysine on turbidity (A) and solubility (B) of tilapia myosin dispersion under low ionic strength conditions

2.2 賴氨酸誘導低離子強度下肌球蛋白Zeta-電位的變化

電位的重要意義在于其數值與體系分散的穩定性相關，通常用來表征粒子在溶液中的表面性質，是對顆粒之間相互排斥或吸引度的度量，分子分散粒子越小電位（正或負）越高，體系越穩定[21]，當吸引力超過排斥力時，就會發生凝結或聚集。如圖2所示，未經賴氨基酸處理及酸堿處理時，KCl濃度在1～150 mmol/L范圍內，隨著離子強度的增加，肌球蛋白Zeta-電位的絕對值越小，這是由于離子強度的增加會產生對蛋白分子表面擴散雙電子層的壓縮作用，使得蛋白的Zeta-電位增加[22]。賴氨酸處理后，體系KCl濃度為1 mmol/L時，與對照組相比，處理后肌球蛋白體系的Zeta-電位的絕對值較大，說明了賴氨酸的加入改變了蛋白分子間的相互作用，使得蛋白的溶解度增加，Zeta-電位的絕對值減小。也說明了賴氨酸誘導肌球蛋白增溶的效果明顯，體系更為分散。研究發現在包含His的蛋白溶液中，肌球蛋白Zeta-電位的絕對值增大，蛋白的溶解度增加[22]。不同離子強度下，賴氨酸處理組和酸堿處理組Zeta-電位的絕對值與對照組相比均出現了增大的趨勢，這說明了表面Zeta-電位的增加可以增大粒子間的靜電斥力，破壞蛋白聚合物以及抑制蛋白聚集體的形成。也說明了兩種不同的處理方式都增強了蛋白分子內部的靜電斥力，使其溶解度變大。賴氨酸處理可以誘導肌球蛋白形成較小的微粒，比如肌球蛋白單體具有較高的Zeta-電位，因此溶解度增加。但Zeta-電位的結果只能是定性判斷賴氨酸對肌球蛋白的作用，具體是否會對肌球蛋白的高級結構有影響以及其他相互作用的參數還要借助熒光、CD儀等其他手段進行研究。

圖2 低離子強度下賴氨酸對羅非魚肌球蛋白體系Zeta-電位的影響Fig. 2 Effect of L-lysine on zeta potential of tilapia myosin under low ionic strength conditions

2.3 賴氨酸誘導低離子強度下肌球蛋白表面疏水性的變化

圖3 低離子強度下賴氨酸對羅非魚肌球蛋白體系表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of L-lysine on surface hydrophobicity of tilapia myosin under low ionic strength conditions

表面疏水性可以表征肌球蛋白疏水基團和極性環境的結合數目，是維持蛋白三級結構的主要作用力，而疏水基團與極性環境的結合數目可以用來衡量分子間相互作用的強弱[23]。因此通過分析表面疏水性的變化，可以了解蛋白質分子間及蛋白質與其他分子間的相互作用、蛋白質結構的變化等。由圖3可知，在KCl濃度為1 mmol/L時，肌球蛋白的表面疏水性最小，這是因為此時肌球蛋白的溶解度較小，分子主要以粗絲狀態存在；隨著離子強度升高，表面疏水性逐漸增大，這是因為隨著離子強度的升高，肌球蛋白的溶解度逐漸變大，分子由粗絲狀態逐漸變為單體狀態，暴露出更多的疏水基團，與ANS充分結合，使得表面疏水性增大。KCl濃度為60 mmol/L及以上時，經賴氨酸處理后，肌球蛋白的溶解度增大，體系中有更多的肌球蛋白單體存在，使得更多的疏水基團暴露，促使其表面疏水性顯著增大（P＜0.05）。在較低離子強度下（1～40 mmol/L KCl），與對照組相比，賴氨酸處理組表面疏水性增幅不顯著也說明了低離子強度下溶解度的增加不僅僅是由電荷的改變引起的。在未經處理的肌球蛋白中，許多非極性基團（疏水基團）被包埋在分子內部[24]，因而疏水性較低，然而賴氨酸的添加使得肌球蛋白的分子結構展開，溶解性增加，芳香族氨基酸分子的側鏈基團逐漸暴露于水溶液中，其所處環境極性增強，導致其表面疏水性增大[25]。但不同pH值條件下的肌球蛋白的表面疏水性也不同，酸堿處理組的肌球蛋白在同一種離子強度下的表面疏水性較對照組都有增大的趨勢，這是由于在堿性條件下，電荷的影響同樣會促使蛋白分子結構展開，疏水基團分布發生改變，表面疏水性增大。并且Huang Weining等[26]研究發現添加劑與蛋白分子之間首先通過兩者之間所帶電荷發生靜電結合；然后小分子的碳氫鍵尾部滲透到蛋白質的極性區域，小分子的疏水鍵與蛋白分子的疏水側鏈結合，導致疏水作用發生變化。對比酸堿處理組和賴氨酸處理組發現二者的表面疏水性沒有明顯差別（P＜0.05），這就說明了表面疏水性的增加主要是由電荷改變引起的。

2.4 賴氨酸誘導低離子強度下肌球蛋白α-螺旋含量的變化

圖4 低離子強度下賴氨酸對羅非魚肌球蛋白CD圖譜及α-螺旋含量的影響Fig. 4 Effect of L-lysine on CD spectrum and α-helix content of tilapia myosin under low ionic strength conditions

賴氨酸處理后肌球蛋白二級結構的變化用CD表征。

α-螺旋主要靠多肽鏈上羰基（—CO）和氨基（—NH）之間的氫鍵維持，此外靜電相互作用也有影響[15,27]，CD光譜在208 nm和222 nm波長處的兩個負峰是α-螺旋的特征峰。由圖4可以看出，當KCl濃度為1 mmol/L時，肌球蛋白呈粗絲狀態，溶解度較低，α-螺旋含量最低，隨著鹽濃度的增大，可溶性肌球蛋白α-螺旋含量增加，可能是因為肌球蛋白是鹽溶性蛋白，隨著離子強度的增強肌球蛋白分子表面的電荷增加，增加了肌球蛋白與水分子的相互作用，使得肌球蛋白的溶解度增大，分子結構展開。賴氨酸處理后，肌球蛋白的溶解度增加，但是其α-螺旋含量卻是降低的。當KCl濃度為1、150、600 mmol/L時，賴氨酸處理組均被發現肌球蛋白的CD圖譜丟失一個肩峰，這是由于賴氨酸處理可以增加蛋白的溶解度，使得蛋白分子結構展開，二級結構發生重排，導致肌球蛋白桿狀尾部發生解螺旋，α-螺旋結構逐漸向無規卷曲狀態轉變。不同離子強度下，肌球蛋白的α-螺旋含量與對照組相比均有下降，這說明了肌球蛋白的二級結構受到破壞，這與Takai等[9]關于賴氨酸誘導豬肌球蛋白增溶但不破壞其二級結構的研究結果不同。對應酸堿處理后發現，肌球蛋白的α-螺旋含量隨著離子強度的增加呈現逐漸增大的趨勢，且酸堿處理組α-螺旋含量大于其他處理組，這說明了酸堿處理后，蛋白受到電荷的影響，溶解度增加，有更多的單體出現，使得α-螺旋含量有所升高。從CD圖譜中可以發現賴氨酸處理組在208 nm和222 nm波長處的橢圓率較對照組有下降趨勢[28]，說明α-螺旋結構的丟失[15,29]。在600 mmol/L KCl下，與賴氨酸處理組相比，pH值對肌球蛋白α-螺旋含量影響明顯較小，可能是由于離子中和了蛋白表面電荷，減弱了電荷對氫鍵影響[30]。

2.5 賴氨酸誘導低離子強度下肌球蛋白分子形態的變化

圖5 3 種離子強度下對照組、賴氨酸處理組和酸堿處理組羅非魚肌球蛋白體系TEM圖Fig. 5 TEM images of tilapia myosin from control group, lysine treatment group and acid-base treatment group under three different ionic strength conditions

賴氨酸處理后肌球蛋白分子形態的變化見圖5，未經氨基酸處理時，低離子強度下（1 mmol/L KCl）肌球蛋白分子呈分散的細絲狀態，分子間相互交聯，隨著離子強度的增加肌球蛋白絲狀體逐漸拉長形成粗絲；在生理離子強度下（150 mmol/L KCl），肌球蛋白分子逐漸解離，部分以絲狀聚合物的形式存在，在KCl濃度為600 mmol/L時，絲狀體已全部消失，呈現單體或二聚體狀態，這可能是因為高離子強度能夠改變氨基酸殘基解離狀態，增加蛋白與蛋白間的相互作用從而使粗肌絲解體[31]。經過賴氨酸處理后肌球蛋白絲狀體發生了解離，蛋白逐漸分散形成了可溶性的單體結構。當KCl濃度為1 mmol/L時，與未處理的體系比較，肌球蛋白變粗、拉長并彎曲，分子結構更為雜亂；KCl濃度為150 mmol/L時，肌球蛋白呈分散的單體狀，與KCl濃度為600 mmol/L時形態極為相似，可能是賴氨酸的作用對肌球蛋白分子形態的影響比中性鹽更大。KCl濃度為600 mmol/L時，賴氨酸對肌球蛋白基本無影響，TEM下觀察基本無變化，溶解性較好，蛋白呈分散的單體或寡聚體。酸堿調節處理后發現，肌球蛋白在弱堿條件下微觀結構發生了變化，在低離子強度（1 mmol/L KCl）下變化較為明顯，絲狀體頭部與尾部有聚集交聯的狀態存在。比較賴氨酸處理組和酸堿處理組發現，相同KCl濃度下，賴氨酸處理組更為分散，這同溶解度及結構的變化相照應，同時結合溶解度的變化說明賴氨酸比酸堿處理增溶效果更好。這充分說明了賴氨酸的增溶機理不只和體系電荷的改變有關，還有可能與賴氨酸與肌球蛋白分子的特異性結合有關。

隨著KCl濃度的增大，肌球蛋白絲狀體逐漸解離，研究結果同組氨酸對低離子強度（1～50 mmol/L KCl）條件下雞胸肉肌球蛋白影響的圖像分析結果相似[22]。結合以上肌球蛋白二、三級結構的變化，賴氨酸的增溶機理也可能與干擾肌球蛋白分子間的靜電相互作用而導致纖絲解離有關。

3 結 論

實驗范圍內，5 mmol/L賴氨酸能顯著提高低離子強度下肌球蛋白的溶解度，并使濁度變小；賴氨酸處理后低離子強度下肌球蛋白的表面疏水性顯著增加，α-螺旋含量減小，說明了疏水相互作用是賴氨酸增溶的原因；賴氨酸處理后，肌球蛋白Zeta-電位的絕對值增大，說明了賴氨酸的加入增大了蛋白之間的靜電斥力；TEM的結果顯示，賴氨酸處理后，肌球蛋白的微觀結構發生了很大的變化，隨著離子強度的增加蛋白細絲狀逐漸拉長解離為單體，蛋白的溶解度升高。高離子強度下，肌球蛋白的微觀結構幾乎沒有變化。對應酸堿處理后體系的濁度降低，溶解度明顯提高，這說明了pH值的變化也可以提高肌球蛋白溶解度；由于電荷的影響，肌球蛋白Zeta-

電位絕對值顯著增大，這同溶解度的變化一致；酸堿處理后肌球蛋白體系的表面疏水性增加，α-螺旋含量增大，這說明了賴氨酸處理組和酸堿處理組的增溶機制并不完全相同；酸堿處理后，低離子強度下出現肌球蛋白絲狀頭部與尾部聚集交聯的狀態，結果與賴氨酸處理組不盡相同。綜上表明賴氨酸的增溶效果可能是由于靜電相互作用和疏水相互作用引起的，但也不能排除賴氨酸能夠與肌球蛋白分子內部結合，通過改變肌球蛋白分子結構而引起增溶。

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