紹興香榧堅果品質變異分析及綜合評價

孫小紅，王國夫，杜軼君，胡紹泉，葛 建*

香榧（Torreya grandis ‘Merrilli’）屬于紅豆杉科榧屬常綠喬木，是榧樹（Torreya grandis）中的變異類型經人工培育而成的優良品種，也是目前榧樹中惟一進行人工栽培的品種[1-3]。香榧種子風味獨特、營養豐富，是一種特殊的干果，并具有藥用、食用等多種用途，在抗氧化、抗炎、抗艾滋病、降血脂等方面有一定功效[4-5]。2013年5月29日，紹興會稽山古香榧群被聯合國糧農組織認定為全球重要農業文化遺產保護試點單位。這是全球首個以山地經濟林果為主要特征的農業文化遺產利用系統，也是紹興第一個世界級農業文化遺產[6]，受到世人矚目。香榧價格一直居高不下，為堅果之首，因此也出現了以次充好、陳年香榧等不良情況，不少地方栽培后出現產量低、品質差等問題[7-8]，影響香榧聲譽。香榧種植地的土壤、水質和氣候都會影響香榧的品質，所以香榧品質的評價較為復雜。對香榧堅果品質特性進行系統科學的綜合評價具有重要意義。但目前針對香榧綜合性狀指標的分析方法尚沒有統一的標準。

堅果品質性狀評價的指標有很多，單純依據某個或某兩個指標評價會讓評價結果不全面；因此，要進行多指標綜合評價分析。傳統的品質評價方法多采用對品質性狀進行描述和打分，這種方法雖簡單易行，但標準不統一，主觀性強，評價結果也不夠合理[9]；而主成分分析方法是目前品質綜合評價的一種有效方法[10-13]。

因此，本實驗對來自紹興會稽山香榧主產區的香榧綜合性狀進行對比研究，對收集的去除假種皮前后的種蒲、種核，在測定21 個香榧品質指標的基礎上，借助相關性分析和主成分分析等多元統計方法，對取得的各相關品質指標值進行綜合分析，構建香榧品質的綜合指數，從而可以得出某地區香榧對應的平均綜合指數，對企業的收貯和加工具有指導意義，也為紹興香榧優質栽培和新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依據已認定的地理標志產品的產地和主產區作為香榧采集地點，分別在諸暨、嵊州和紹興進行采集，編號為1～12。其中1～3號樣品來自諸暨趙家鎮，4～8號樣品來自嵊州松明培村和白雁坑村，9～11號樣品來自紹興稽東鎮，12號樣品為圓榧，取自嵊州白雁坑。采集標準是：1～11號香榧樹都為人工嫁接，樹齡在300～500 年，海拔在300～600 m之間，選取30～40 株樹，在每株樹冠的南面中上部隨機采10 個充分成熟的堅果（未去掉假種皮的香榧種蒲）。實驗所用樣品均選擇飽滿的堅果，樣品采后測定種蒲各項指標，放于通風、干燥處，腐熟后剝去青皮，晾曬過程中要隨時翻動，使其干燥均勻，當堅果的含水量小于8%時即可，放于溫度為0～4 ℃的干燥、密閉處進行保存，待測。

所有有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

KDN-08A凱氏定氮儀 上海庚庚儀器設備有限公司；紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；6890N/5975MSD氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 種子物理性質測定

采用常規方法測定每種樣品30 個堅果的數量指標：用游標卡尺測定種蒲長度、直徑，種子長度、直徑，種核長度、橫徑，種殼厚度，分別得出果形指數（長度與直徑之比）和種形指數（長度與直徑之比）；種殼質量及單果質量采用電子分析天平測定。

1.3.2 種子內在品質測定

將每份香榧干燥至恒質量（前后兩次稱量差不超過0.002 g），去殼，然后將仁粉碎均勻用于測定其內在品質指標。脂肪質量分數測定采用索氏抽提法，以乙醚為溶劑提取仁油，計算出油率，重復3 次，取平均值；蛋白質含量測定采用凱氏定氮法，重復3 次取平均值，測定結果經過換算（全氮質量×6.25）即可得到蛋白質量；多糖質量分數測定采用苯酚-硫酸法[14]。

脂肪酸組分測定參照文獻[15-16]，將待測樣品進行甲酯化后采用6890N/5975MSD氣相色譜-質譜聯用儀測定。氣相色譜條件：采用DB-WAX色譜柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），初始溫度100 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至250 ℃，保持8 min，進樣口溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃，進樣量0.4 μL；載氣（He）流量1 mL/min；分流比為50∶1。定量方法采用面積歸一法，即單個脂肪酸甲酯的質量分數是各個組分峰值面積占色譜圖上的所有組分峰面積總和的百分比。油脂過氧化值、油脂脂肪酸酸價測定用GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準的分析方法》。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法測定樣品清除自由基活性[17-18]。

1.4 數據統計分析

采用Excel和SPSS 19軟件統計分析數據，計算各樣品堅果性狀的平均值、標準差及變異系數，并采用Duncan法進行顯著性分析。對各指標均值數據進行標準差標準化，再進行Pearson積矩相關系數法進行相關性分析。參照文獻[19]，綜合21 個品質指標標準差標準化，進行主成分分析和綜合評判。

2 結果與分析

2.1 種子物理性狀的分析

對12 個香榧樣品堅果物理性狀進行分析，從表1可以看出，12 個香榧種蒲長度范圍為2.622～3.435 cm，平均值為3.074 cm，種蒲最長的是5號樣品，來自嵊州白雁坑村的香榧，但去除假種皮后種子并不大，說明該香榧假種皮較厚；種殼厚度范圍為0.060～0.090 cm；果形指數最高的為5號樣品，從外觀上看該香榧較為細長；12 個樣品種子長度的范圍為2.206～3.079 cm，種子質量范圍為1.224～1.773 g，二者變異系數分別為9.20%和10.37%，其變異程度較大。樣品間各指標差異也較為顯著。因此，可以說榧樹種子的大小存在著較大的差異，商品一致性較差，對銷售和加工有一定影響。本實驗所采用的香榧樹都是來自各地300～500 年生的香榧樹，已經進入盛產期，這些香榧都是幾百年前通過嫁接繁殖，其接穗來源不一，難以統一來源，目前市場上主要香榧來源于這些榧樹。再加上近幾年香榧銷量好，榧樹花粉來源有東陽、磐安，甚至外省安徽，造成香榧籽外觀差異較大。嵊州、諸暨以及紹興稽東雖然同為會稽山區，但是溝壑縱橫，由于坡度、坡向和海拔等的不同，極易形成局部山地小氣候，對香榧的外觀品質產生很大影響[20-24]。

表1 香榧種子物理性狀分析Table 1 Physical properties of T. grandis ‘Merrilli’ nuts

表2 香榧種子各性狀間相關性分析Table 2 Correlation analysis among physical parameters of T. grandis ‘Merrilli’ nuts

各種子性狀參數的相關性分析（表2）表明，種蒲長度和種子長度，果形指數和種形指數相關性最大，相關系數分別為0.939和0.956。種蒲直徑與種蒲長度、種子長度相關性不顯著，種殼厚度與種蒲長度、種子長度相關性也不顯著。其余參數兩兩之間或者呈顯著正相關，或者呈顯著負相關；其中果形指數與種形指數呈極顯著正相關，說明種核的大小隨果形大小變化而變化；種子質量與種蒲長度、種蒲直徑、種蒲質量，種子長度以及種子直徑都呈顯著正相關。這與沈登鋒等[25]的研究結果基本一致。種子質量與果形指數、種形指數相關性不大，與李揚等[26]研究結果基本一致。

2.2 香榧種子內在品質

2.2.1 種子脂肪質量分數測定結果

表3 香榧種子各主要成分分析Table 3 Chemical properties and antioxidant activity of T. grandis ‘Merrilli’ nuts

堅果的香脆程度與種子含油率呈正相關[27]，因此，脂肪含量多少是重要的質量指標之一。通過對12 個香榧種子樣品分析（表3）可知，12 個香榧種子種仁平均油脂質量分數為50.28%，變異系數為12.31%，而且不同產地之間差異顯著（P＜0.05）。其中香榧種子種仁油脂質量分數最高為12號樣，達61.20%，該樣品取自嵊州，為圓榧品種，口感較差，商品價值低，但含油量高，值得進一步開發研究。不同產地香榧油脂變異范圍大，遺傳變異豐富，選擇潛力大，通過育種途徑改良香榧品質性狀是可行的。

2.2.2 種子蛋白質含量測定結果

蛋白質含量是衡量香榧營養價值的一個指標。由表3可知，1 2 個香榧種仁蛋白質平均含量為12.70g/100 g，變異系數為24.40%。同樣來自嵊州的香榧樣品（4～6號）中，5號樣品種子蛋白質含量顯著高于其他組的蛋白質含量，說明即使是同一地方的香榧樣品，由于栽培管理方式不同，其營養成分積累也有差異。來自諸暨的3 個樣品（1～3號樣）蛋白質含量較其他組含量相對低，差異顯著（P＜0.05）。特別是2號和3號的種子，蛋白質含量更低，與最高組香榧5號樣差異顯著[28]。說明遺傳多樣性比較豐富，商品一致性較差。

2.2.3 種子多糖質量分數測定結果

對12 個不同香榧種子進行分析測定，由表3分析表明不同產地香榧多糖質量分數差異顯著，最高值與最低值甚至達2 倍。香榧種子多糖質量分數以9號樣和12號樣質量分數最高，分別達1.295%、1.337%，而2號樣和4號樣最低，僅為0.659%、0.658%；12 個香榧種仁多糖質量分數平均為1.020%，變異系數為23.00%。

2.2.4 香榧種子油脂過氧化值、酸價以及抗氧化能力測定結果

油脂過氧化值和酸價是衡量堅果品質優劣的重要指標之一。由表3可知，12 個香榧種子油脂的過氧化值范圍在0.033 5～0.089 6 meq/kg。不同產地香榧種子油脂過氧化值存在顯著差異。但與GB 2716—2005《食用植物油衛生標準》相比（≤9.85 meq/kg），其數值都偏低。說明香榧種子油脂品質較好。12 個香榧種子酸價范圍在1.29～2.55 mg/g（≤3 mg/g）。不同產地香榧油脂酸價差異顯著。DPPH自由基是一種穩定的自由基，被廣泛用來測定各種樣品的抗氧化活性。由表3可知，12 個香榧種仁油脂DPPH自由基清除作用的IC50范圍為8.23～13.76 mg/mL，平均值為10.09 mg/mL，變異系數為13.60%。IC50越小，說明該香榧籽油對DPPH自由基清除能力越強，抗氧化能力越強。多重比較分析結果表明，不同產地香榧籽油抗氧化能力不同，存在顯著差異。但本次實驗所得結果數據明顯高于文獻，可能與香榧籽油提取以及產地不同相關[29-30]。

2.2.5 香榧種子脂肪酸質量分數分析

表4 香榧種子脂肪酸質量分數分析Table 4 Fatty acid composition of T. grandis ‘Merrilli’ nuts

將香榧油脂甲酯化后，應用氣相色譜-質譜聯用方法測定脂肪酸的組成和質量分數，結果見表4。香榧種仁油脂以亞油酸、油酸為主，另外在油脂中還發現了較多的二十碳二烯酸、二十碳三烯酸等不飽和脂肪酸，不同產地香榧種仁不飽和脂肪酸所占比例在60.08%～75.77%，平均質量分數為71.80%。榧樹油脂中脂肪酸在產地間存在不同程度的變異。其中油酸變異較大。來自諸暨的樣品，香榧種仁不飽和脂肪酸質量分數較高。目前來自該區域的香榧售價也較高。

2.3 香榧堅果品質綜合評判

2.3.1 主成分的提取

表5 主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率和權重Table 5 Characteristic values, variance contribution rate, cumulative variance contribution rate and weight of principal components

由于各指標間存在著一定的相關性，若直接用原來21 個指標對各品種進行評價會導致大量的信息重疊，不但工作量大，而且評價結果不理想，因此需要進行主成分分析及綜合評判。21 項指標經主成分分析后提取出6 個主成分，它們的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率及權重見表5。提取的6 個主成分特征值大于1，累計方差貢獻率為90.70%，可以全面地反映各指標的信息量，其中第1主成分的方差貢獻率最高，為31.35%，權重為0.31，所體現的變量信息最多。

2.3.2 函數的建立及分析

主成分分析顯示21 項指標公因子方差均大于0.9，表明所提取的6 個主成分可以較好地體現原始變量信息。在第1主成分中油脂質量分數、種蒲長度、種子長度、果形指數，種形指數正相關，這些性狀均與果實及種子性狀有關，則稱第一主成分為香榧堅果大小因子；第2主成分中，種蒲質量、種子質量、蛋白質量系數較大，反映了香榧堅果核仁的特征，可以作為堅果核仁因子；第3主成分中油酸質量分數、亞油酸質量分數、香榧籽油對DPPH自由基的清除作用（IC50）及酸價的系數較大，反映了各香榧的脂肪質量分數特征，可作為脂肪因子；第4主成分中堅果多糖質量分數系數較大，反映了各堅果多糖質量分數特征，可作為多糖成分因子；第5主成分中過氧化值的系數較大，反映了各樣品過氧化值特征，可作為堅果油脂品質特征。第6主成分與硬脂酸質量分數相關。總的方差近60%的貢獻率來自前3 個主成分，所以可認為種子長度、果形指數、種形指數、油脂質量分數、種子質量、蛋白質含量、油酸和亞油酸質量分數是評價香榧品質的重要指標，這幾個指標的變化將在很大程度上影響香榧堅果質量和等級評價，此結果也與市場供需實際情況相符合，因此今后在香榧育種及質量評價等工作中應側重對種子長度、果形指數、油脂質量分數、種子質量、蛋白質含量、油酸和亞油酸質量分數指標的研究。通過將6 個主成分的特征向量與相應權重的積進行累加的方法構建了香榧堅果品質綜合評價指數。根據以上分析，可以列出香榧堅果品質綜合評價指數的函數表達式如下：堅果品質綜合評價指數＝（31.35F1＋23.71F2＋13.34F3＋9.23F4＋7.74F5＋5.34F6）/90.70。綜合主成分F值越高，綜合品質表現越好。

2.3.3 堅果品質綜合評價

表6 香榧堅果綜合評價指數及優良度排序Table 6 Ranking of comprehensive scores for nut quality of T. grandis ‘Merrilli’ nuts

由各主成分函數表達式計算出12 個香榧堅果樣品品質綜合評價指數，并對其進行排序，結果如表6。其中，4、5、7號3 個香榧堅果樣品品質綜合得分較高，即堅果品質最好。9、11、12號3 個香榧堅果樣品品質綜合得分最低，即9、11、12號香榧堅果品質差。其他樣品品質居中。

2.3.4 堅果品質聚類分析

圖1 香榧堅果品質聚類分析Fig. 1 Dendrogram obtained from cluster analysis of nut quality of T. grandis ‘Merrilli’

對12 個香榧樣品21 個堅果品質指標進行聚類分析，對通過聚類分析分成的4類品種做方差分析，結果可看出，當距離為10左右時，12 個香榧樣品被分為了A、B、C 3 類（圖1）。從圖1看出，C類只有12號樣品，說明圓榧與香榧品種性狀差異很大。但C類具有油脂質量分數高、油酸質量分數高等特點，可作為優良品種進行選育。A類包含香榧1、2、3、9、10和11號6 個樣品，該類具有油脂質量分數高，種殼薄，種子小、輕，種蒲輕等特點，這6 個樣品分別來自諸暨趙家鎮和紹興稽東鎮，地理位置接近，香榧品質基本一致。B類包含4、5、6、7、8號5 個樣品。具有種子大而長，種子重，種殼薄，蛋白含量高等特點，其外觀較好。

結合主成分綜合得分，綜合比較各類，優劣排序為B＞A＞C。再結合其他方面的性狀，可以對紹興香榧進行全面地比較和選優。種子長度、果形指數、種形指數、油脂質量分數、種子質量、蛋白質含量、油酸和亞油酸質量分數是評價香榧品質質量的重要指標。這幾個指標的變化將在很大程度上影響香榧堅果質量和等級評價。

3 結 論

本次實驗收集了12 個香榧樣品，分別來自紹興、諸暨以及嵊州，為紹興香榧主要核心產區，其管理方式都為精細管理。為科學合理評價香榧品質，對香榧樣品的21 項堅果品質相關指標的變異情況進行了分析，研究結果表明不同地區的香榧外觀性狀有差異，種子長度的范圍為2.206～3.079 cm，種子質量范圍為1.224～1.773 g，其中來自嵊州的香榧種子質量普遍偏大。外在性狀中，種蒲長度和種子長度，果形指數和種形指數相關性最大，相關系數分別為0.939和0.956。種子質量與種蒲長度、種蒲直徑、種蒲質量、種子長度以及種子直徑都呈顯著正相關。通過外觀各項指標可以看出，同一指標間有一定的差異性，商品一致性程度較差，致使目前市場上流通的紹興香榧品質差別較大，應選擇適宜的種子長度、寬度、硬殼厚度等指標，為今后紹興香榧品質均一化提供數據支持。

12 個香榧種子種仁平均油脂質量分數為50.28%，變異系數為12.31%，而且不同產地之間差異顯著。

根據21 項指標，采用主成分分析法對12 個香榧樣品的堅果品質進行了綜合評價，利用6 個主成分建立了綜合評判模型，結果表明4、5、7號3 個香榧堅果樣品品質綜合得分較高，即堅果品質最好。9、11、12號3 個香榧堅果樣品品質綜合得分最低，即9、11、12號香榧堅果品質差。將主成分分析方法用于紹興香榧品質評價，既能把握香榧的綜合性狀，又能簡化選擇程序，較人工打分快捷，更具有科學性[31]。

香榧生產地域性非常明顯，分布高度集中，至今仍局限在會稽山的特定小區域。本研究側重當前香榧在市場炒貨供應方面的指標要求，產于嵊州的香榧個大皮薄且仁多，因而綜合評價結果最好，12號圓榧雖然綜合評價結果最差，但油脂質量分數較高，今后其可作為油料來源開發。

在目前香榧性狀數學評價方法和指標體系尚沒有確定的背景下，主成分分析技術將為香榧堅果質量評價提供方法技術，同時解決該技術的分級方法，具有非常重要的現實指導意義。應用主成分分析法，對不同來源香榧種子綜合品質性狀指標排序，其結果與香榧的實際表型接近。表明主成分分析方法在香榧堅果品質評價和優良香榧選擇上具有較大的應用價值。使用主成分分析方法對紹興香榧堅果品質綜合評判，評價結果理想，可為紹興香榧優良品種篩選和育種提供科學參考。

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