酯化紅曲霉的分離純化及其在固態發酵中的應用研究

單淑芳，丁 咚，趙 穎，徐 君，黃躍勇，張國強

（安徽口子酒業股份有限公司，安徽淮北 235100）

紅曲霉屬于真菌門、子囊菌亞門、不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科（Monascaceae)、紅曲屬（Monascus)，是腐生真菌，能產生紅色色素，可用做食品加工中天然紅色色素的來源，如在紅腐乳、飲料、肉類加工中用的紅曲米，就是用紅曲霉制作的[1-4]。近代發酵工業用它生產葡萄酒、酒精發酵和紅曲色素，以及用于調節血脂、降低血壓等系列功能性紅曲制品等[5]。

高溫季節中的酒醅，由于環境氣溫高,一般都存在酸度高、殘余淀粉高、乳酸菌和雜菌數量多、繁殖快的現象,大量微生物侵入發酵體系中，影響酵母及有益菌的正常繁殖和發酵，從而導致曲酒產量和質量明顯下降。酯化紅曲是由紅曲霉等多種產酯功能菌混合培養制成，是復合菌劑、生物酶和活菌體的生態混合體[6]。紅曲霉具有嗜酸的特性，尤其是嗜乳酸，能夠利用乳酸為碳源繁殖發酵，解除了酸對微生物細胞的毒害作用，因而在白酒生產中能降低酒醅中乳酸和乳酸乙酯的含量；紅曲霉本身可以代謝產生己酸乙酯合成酶，加快白酒中己酸乙酯的生成速度，提高酯化率，從而達到提高優質酒率的目的[2]。

為了改進安徽口子酒傳統大曲的生化性能，提高白酒的優質品率，我公司以酯化紅曲為含菌源，分離出酯化力強的功能菌種。以此為試驗菌株，經固態純種培菌發酵，按一定比例添加到制曲原料中，制成強化大曲，或是直接與大曲混合，添加到酒醅中進行發酵。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

原料：紅曲，某企業取樣。

儀器設備：立式恒溫生化培養箱，螺旋管蒸餾器，顯微鏡，高壓滅菌鍋，玻璃量筒，玻璃燒杯，三角瓶，試管，吸管，培養皿，酒精燈，涂布棒，安捷倫6820氣相色譜儀等。

1.2 試驗培養基

1.2.1 分離純化培養基

麥芽汁培養基：麥芽浸膏30 g 、瓊脂15 g、水1000 mL、pH5.5左右、121℃滅菌15 min。

改良麥芽汁培養基：麥芽浸膏30 g、瓊脂15 g、酒精10%vol、水1000 mL、乳酸調pH3.5左右、121℃滅菌15 min。

1.2.2 試管斜面培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL、pH值自然。

1.2.3 液體種子培養基

麥芽汁液體培養基：麥芽汁浸膏30g，水1000 mL，pH值自然。

1.2.4 三角瓶培養基

大米培養基：大米用蒸餾水浸泡24 h(米∶水=1∶1）,按每瓶50 g干料裝入500 mL三角瓶。

全麩皮培養基：按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，拌濕至手捏成團，松手即散為準，按50 g干料裝入500 mL三角瓶。

大米和麩皮混合培養基：干料大米∶麩皮為2∶1，浸泡24 h的大米和按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，按每瓶50 g干料裝入500 mL三角瓶內，混勻。

1.3 試驗工藝

紅曲酯化酶?分離?純化?母菌?斜面?液體種子?大三角瓶?紅曲擴大生產?紅曲應用于生產

1.4 試驗方法

1.4.1 紅曲酯化酶的微生物分離、純化

分離方法：稀釋涂布平板法。

純化方法：平板劃線法。

1.4.2 菌種的初步鑒定

用肉眼觀察菌落的生長、顏色、表面形態、質地、邊緣形狀等，用顯微鏡觀察菌絲、孢子和子實體結構的形態。

1.4.3 紅曲霉的斜面培養

培養條件：在無菌條件下接入紅曲霉菌種，置入生化培養箱內，35℃培養7～8 d。

1.4.4 液體種子培養

三角瓶液體培養基在無菌條件下接入試管斜面菌種，置入生化培養箱內，以35℃、150 r/min振蕩培養7 d。

1.4.5 三角瓶培養[2]

上述3種培養基置于0.1MPa壓力下滅菌30min，取出冷卻至室溫搖散，使其充分吸收三角瓶壁的冷凝水，根據培養基的干濕情況補充含適量乳酸和乙醇的無菌水，繼續潤料30 min。

用微量移液器吸取10 mL液體種子至三角瓶固體培養基內，將接種好的三角瓶搖勻，然后把物料堆積在瓶的一角，以利升溫，放入32～35℃培養箱中培養。

當大部分物料上可看到菌絲生長時，搖瓶1次，使附在瓶壁上的冷凝水被物料吸收，然后把物料攤開，再繼續培養，隨時觀察曲料的干濕程度，視情況加入無菌水調濕度。

經過一段時間的培養，菌種發育成熟，紅曲色澤深紅，發酵均勻，無雜菌污染，有紅曲特有的曲香味。

將曲料倒出，在40～45℃下進行烘干或在太陽下曝曬，曬干后，用粉碎機粉碎，干凈塑料袋裝好，放在干燥陰涼處保存備用。

1.4.6 酯化力測試

用吸管吸取1.5 mL(約1.5%）己酸于500 mL三角瓶中，再加入25 mL(約25%）無水乙醇，稍加振蕩后加入75 mL蒸餾水，充分混勻，再稱取紅曲粉10 g（絕干曲）于三角瓶中，搖勻后用塞子塞上，置于35℃恒溫箱內保溫酯化7 d。將酯化7 d后的試樣倒入500 mL蒸餾燒瓶中，量取50 mL30%乙醇溶液充分洗滌盛裝酯化液的三角瓶，將洗液一并倒入蒸餾燒瓶中蒸餾，取蒸餾液50 mL，用色譜儀分析蒸餾液中己酸乙酯含量。

1.4.7 氣相色譜條件

色譜柱：DNP不銹鋼填充柱（3 m×3 mm)，柱溫：93℃，進樣口溫度：200℃，檢測器溫度：200℃，載氣：高純氮，柱頭壓0.3 MPa，氫氣壓力：0.06 MPa，空氣壓力：0.05 MPa，進樣量為0.3 μL。

1.4.8 紅曲擴大生產[2]

大米和麩皮混合培養基：干料大米∶麩皮為2∶1，浸泡24 h的大米(米∶水=1∶1）和按1∶1比例加入蒸餾水拌濕的大片麩皮，按每6斤干料放入一個匾配料，用紗布包裹放在托盤中，常壓蒸1 h，然后冷卻至35℃，送入培菌室。

大米培養基：大米用蒸餾水浸泡24 h(米∶水=1∶1），按每6斤干料放入一個匾配料，常壓蒸1 h，然后冷卻至35℃，送入培菌室。

將托盤中的熟料均勻的鋪在培菌室的匾上，厚度3～4 cm，下鋪2層醫用紗布（已滅菌），倒出三角瓶液體種曲與物料充分混合，鋪平，接種比例25%,注意接種過程中盡量避免手與物料接觸。

接種后，保證品溫在30℃左右，每天上下午觀察室溫、品溫及物料的干濕情況，隨時調整室溫，控制品溫不要超過35℃，及時噴灑無菌水。物料色澤深紅，發酵均勻，無雜菌污染，有曲香味，說明菌種發育成熟，即可烘干，粉碎。

2 結果與分析

2.1 酯化紅曲的微生物分離結果

此次分離的培養基是麥芽汁培養基和添加了乳酸和乙醇的改良麥芽汁培養基，分離出了紅曲霉、根霉、毛霉、曲霉、青霉等霉菌（見表1），這說明酯化紅曲是由紅曲霉等多種產酯功能菌混合培養制成，是復合菌劑、生物酶和活菌體的生態混合體。

表1 酯化紅曲中分離出的霉菌

2.2 菌落形態和個體形態觀察

圖1、圖2、圖3、圖4是此次從酯化紅曲中分離出來的1號菌株和6號菌株。

在麥芽汁培養基上培養1號菌株，初期為白色圓形絨毛狀，繼續培養菌落中央變為淺橙色，隨著培養時間的變長，菌落中央的顏色越來越深，呈深橙色，背面顏色更深些，表面絨毛狀氣生菌絲，較易挑取。菌絲有橫隔、分枝，分生孢子著生在菌絲及其分枝的頂端，單生或呈鏈、球形。8號菌株和12號菌株的菌落形態與1號一致（見圖1和圖3）。

6號菌株在麥芽汁培養基上培養初期為白色，以后呈紫紅色，色素分泌到培養基中，背面也是紫色。邊緣整齊，輻射狀，有皺折。表面有膜狀蔓延生長物，干燥、不易挑取。菌絲體有橫隔、分枝，閉囊殼為球形，子囊球形。分生孢子著生在菌絲及其分支的頂端，單生或成鏈、球形（見圖2和圖4）。

這些菌株形態都與紅曲霉屬菌落特征一致，應屬于紅曲霉屬的兩個種，尤其是6號菌株與紫紅曲霉的形態特征描述基本一致，如需要確定到種，還需通過分子測序技術進一步鑒定。

圖1 1號菌株宏觀形態

2.3 三角瓶培養紅曲酯化力測定結果

三角瓶培養選取大米培養基、麩皮培養基和大米、麩皮混合培養基培養，培養15 d以后，曬干、粉碎，測水分、酯化力，色譜分析結果見表2。

從實驗結果看，大米培養基和混合培養基上的紅曲霉發酵產物酯化力相當，都明顯高于純麩皮培養基，可能是麩皮的營養不足以滿足紅曲霉的生長代謝。從4株菌株發酵產物酯化力來看，相同培養基比較，菌株之間無顯著差異。純麩皮培養的酯化力比外購紅曲略高，純大米和混合培養的酯化力顯著高于外購紅曲。

圖2 6號菌株宏觀形態

圖3 1號菌株微觀形態

圖4 6號菌株微觀形態

三角瓶培養選取大米培養基、麩皮培養基和大米、麩皮混合培養基培養。

⑤大米培養基上接種的菌株3 d后，全部產紅色素或紫紅色色素。

表2 三角瓶培養紅曲酯化力測定結果 (mg/100 mL)

⑤麩皮及混合培養基1號、8號、12號菌株都長有白色菌絲，6號菌株產少量紫紅色色素。

⑤混合培養基長勢良好，布滿白色菌絲，到后期因營養匱乏，漸漸停止生長。

⑤麩皮培養基上菌絲長勢較弱，較開始幾天長勢緩慢，瓶壁上有小水珠生成，有可能是菌體自身新陳代謝產生的水分，所以后期不用再噴水，而需排濕。

⑤大米培養基到后期菌絲生長旺盛，并產大量紅色或紫色色素，從酯化力來看，大米培養基較適宜于紅曲霉生長，麩皮培養基營養不足以滿足紅曲霉的生長代謝，酯化力較低。隨機選取的4株菌株同培養基之間酯化力也無顯著差異。

2.4 第一批擴大培養紅曲酯化力測定結果

根據三角瓶培養的結果可以看出，大米培養基和大米、麩皮混合培養基培養的紅曲酯化力較高，單純麩皮培養基營養匱乏，所以此次擴大培養選取大米培養基和混合培養基培養。培養7 d左右，菌絲在料中基本長透，且已產紅色色素，即已成熟，取出晾干、粉碎，做酯化力測定，色譜分析結果見表3。

此次培養，由于溫濕度沒有控制好，除12號菌株大米培養基正常發酵沒有污染外，其他所有菌株培養發酵的培養基全部都有不同程度的腐爛、發臭，晾干、粉碎后，測其酯化力，12號菌株的大米培養發酵產物酯化力明顯高于其他培養基發酵產物。從此次污染的結果也可以看出，污染越嚴重，酯化力越低，說明紅曲霉相對于其他霉菌、細菌在酯化能力上還是起到很大作用的。

表3 第一批擴大培養紅曲酯化力測定結果(mg/100 mL)

根據三角瓶培養的結果，第一次擴大培養選取大米培養基和混合培養基培養，菌種仍是以上4株菌株。

在第一次擴大培養過程中，發現混合培養基保濕性好，前期產熱快，說明紅曲霉在其中代謝生長快，由于沒有及時降低品溫及室溫，中后期菌絲已停止生長，物料發臭。大米培養基開始水分低，鎖水性差，后期培養過程中很容易蒸發造成水分散失，因此要頻繁觀察其干濕情況，以免影響生長，到中后期品溫突升，沒有及時降低室溫及品溫，導致此次擴大培養物料大多發臭，因此酯化力也相當低，只有12號菌株在大米培養基上培養沒有污染，溫濕度控制適宜紅曲霉生長，酯化力相應的要高些。

2.5 第二批擴大培養紅曲酯化力測定結果

第一次擴大培養只有12號菌株在大米培養基上培養沒有污染，長勢很好，酯化力也很高，其他都已經有污染；總體來看大米、麩皮混合培養基培養的紅曲酯化力不如大米培養基培養的好，所以此次全部選用大米培養基培養，色譜分析結果見表4。

此次擴大培養，在第一次失敗的基礎上，總體來說溫濕度控制還不錯，酯化力測試結果都挺高。比較各菌株在大米培養基上的發酵產物，1號菌株和6號菌株己酸乙酯都在790 mg/100 mL左右，12號菌株和混合菌株己酸乙酯都在850 mg/100 mL左右，相對于同等條件下的外購紅曲均高很多。

表4 第二批擴大培養紅曲酯化力測定結果(mg/100 mL)

綜合三角瓶培養和第1次擴大培養的紅曲酯化力發現，大米培養基是較適宜紅曲霉生長的培養基，第2次擴大培養全部選用大米培養基培養。

大米要蒸透，軟而不黏，剛接種時室溫不能太高，由于培養基溫度高，若室溫也高，加上菌種自身生長代謝產熱，容易導致品溫上升過快，菌絲剛長出又因溫度高而被抑制。漸漸地大米會在高溫環境中慢慢腐爛，培養基中氧氣漸漸變少，新長出的菌絲也因無氧氣及高溫而被抑制生長。因此，接種后的第2天要根據品溫及時地調整室溫。掌握好這一點，后期主要觀察其干濕情況，調節干濕度。5～6 d的培養，曲外觀色澤鮮紅或白色，手抓起來很輕，有特有的曲香味，即已成熟，取出，晾干，粉碎，做酯化力測試，色譜分析結果顯示，酯化力比外購紅曲要高出2倍多。

3 結論

此次試驗以酯化紅曲為含菌源，分離純化出酯化力強的功能菌種紅曲霉。經形態觀察，初步確定此次分離出的紅曲菌種為兩種紅曲霉。選取其中4株為試驗菌株，在不同的培養底物中，經固態純種發酵制成固態紅曲，從氣相色譜儀測定其酯化力大小來看，大米較適宜于紅曲霉生長代謝。在用大米作為培養底物時，大米要蒸透，軟而不黏，剛接種紅曲霉時，要注意室溫的控制，根據品溫情況及時調節室溫，掌握好這一點是重中之重，后期主要觀察其干濕情況，調節干濕度。另外，從三角瓶培養和第2次擴大培養結果看，選取的4株菌株同培養底物之間酯化力無顯著差異。

接下來的試驗要看在酒醅中能否提高出酒率，達到“增己降乳”的效果，如果一切順利，則本試驗應該針對紅曲霉的培養條件、酯化過程條件控制等方面繼續進行研究。

[1]胡曉龍,趙東,葛隱,等.五糧液大曲中產酯化酶紅曲霉的分離及酯化酶的純化[J].釀酒,2011(3)：35-38.

[2]程江紅,何汝良,程江浩,等.酯化紅曲工藝研究及在釀