酸性蛋白酶在小麥淀粉乳酒母培養中的應用

方頌平，梁臣臣，田啟梅，程抱奎，戚春江，周鵬磊，郭文杰

（安徽瑞福祥食品有限公司，安徽亳州 236800）

酒母培養是酒精發酵的重要環節，酒精發酵過程中酒母培養的好壞，直接影響酒精出酒率。以玉米、木薯、糖蜜等為原料生產酒精[1]，酒母培養通常要求外觀糖度在10°Bx左右，培養過程中需添加尿素、磷酸二氫鉀等無機鹽，促進酒母生長繁殖。以小麥粉提取谷朊粉后的淀粉乳生產酒精[2]，淀粉乳中含有大量水溶性蛋白，在酒母培養過程中添加酸性蛋白酶，將部分水溶性蛋白分解為酵母可利用的短肽、氨基酸等有機氮源[3-4]，為酵母細胞的生長提供豐富的營養物質，可少用或不用營養鹽，減輕酒精廢水COD和磷的處理負荷[5]；此外，傳統原料酒母培養要求外觀糖度在10°Bx左右，本試驗通過不稀釋糖化醪進行酒母培養，提高了發酵醪的酒精度，降低了酒精生產的能耗成本。

本試驗以小麥淀粉乳為原料，研究小麥酒精生產過程中不稀釋酒母培養工藝，通過調節pH值和添加酸性蛋白酶的方式，達到酒精生產所要求的酒母培養質量要求，為小麥酒精工藝優化和節能降耗提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥淀粉乳，安徽瑞福祥食品有限公司；淀粉酶100000 U/g，杰能科（中國）生物工程有限公司；糖化酶200000 U/g，杰能科（中國）生物工程有限公司；酸性蛋白酶100000 U/g，杰能科（中國）生物工程有限公司；耐高溫釀酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：顯微鏡（BX41 OLYMPUS）；恒溫搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司；40 m3酒母培養罐。

1.2 檢驗方法

鏡檢：采用血球計數板和次甲基藍染色法，測定酒母醪中的酒母細胞數、出芽率和死亡率。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖化醪的制備

取谷朊粉車間A/B混合淀粉乳，固形物濃度在20%左右，加一定量的耐高溫α-淀粉酶，水浴鍋煮沸，液化60 min，降溫至60℃，添加糖化酶，60℃糖化40 min，降溫至30℃，即可。

1.3.2 試驗室培養酒母

取100 mL糖化醪置于500 mL三角瓶內，加入干酵母，按不同試驗條件，在恒溫搖床進行酒母培養，培養時間6 h，培養溫度30℃，搖床轉速100 r/min。

1.3.3 車間40 m3酒母罐循環培養酒母

酒母罐滅菌后，注入車間制備的糖化醪，加入復活后的酵母，按不同試驗條件，通入空氣，開啟攪拌，溫度控制在30℃，第一罐培養10 h，此后每罐培養8 h，計數酵母，每次培養結束后放出2/3酒母醪，重新補足糖化醪和酸性蛋白酶。

2 結果與分析

2.1 不同營養鹽對酒母培養的影響

本試驗中，對照組使用稀釋后的糖化醪，營養鹽為尿素和磷酸二氫鉀，添加量為0.025 g和0.0125 g；試驗組采用不稀釋糖化醪，酸性蛋白酶添加量為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L，培養結果見表1。

表1 不同營養鹽培養結果

酒精發酵的主體是酵母菌，強壯的酵母細胞可耐受更高濃度醪液和酒精，試驗中通過檢測酵母生長狀況，發現添加酸性蛋白酶，對酵母細胞的生長繁殖有明顯的促進作用。

由表1可以看出，在不稀釋的糖化醪中加入酸性蛋白酶可顯著提高酒母細胞數和出芽率，同時死亡率顯著下降。當酸性蛋白酶添加量為5 mg/L時，酵母細胞數已超過無機鹽的1.5倍，這表明酸性蛋白酶加入到小麥淀粉糖化醪中起到了預期的效果，酸性蛋白酶可替代無機營養鹽進行不稀釋酒母培養。由于小麥淀粉中營養物質貧乏，僅依靠添加無機鹽并不能完全提供酒母生長所需要的營養，而小麥淀粉乳中含有大量的水溶性蛋白，這部分蛋白不能直接為酵母細胞利用，通過加入酸性蛋白酶，將水溶性蛋白分解為酵母細胞可利用的游離氨基酸，為其生長提供豐富的有機氮源，可促進其代謝與繁殖。

圖1 不同酸性蛋白酶添加量對酵母細胞數和出芽率的影響

由圖1可知，隨著酸性蛋白酶用量的增加，酒母細胞數和出芽率均增長，但在添加量達到10 mg/L后，兩者都未再出現明顯的增加。因此，從經濟角度考慮，酸性蛋白酶的適宜添加量為10 mg/L。

2.2 不同pH值對不稀釋醪酒母培養的影響

由于酵母細胞對pH值要求較為嚴格，pH值過高或過低都會影響酵母細胞的生長。此外，醪液中的pH值會影響酸性蛋白酶的使用效果，進而影響酵母細胞的生長繁殖。小麥淀粉乳由于加工工藝較長，淀粉乳pH值在5.0左右，因此有必要研究不同pH值下，酸性蛋白酶對酵母生長的影響。

本試驗中，酸性蛋白酶添加為10 mg/L，調節糖化醪初始pH值分別為3、4、5、6、7，培養結果見表2和圖2。

表2 pH值對酸性蛋白酶培養酒母的影響

圖2 不同初始pH值對酵母細胞數和出芽率的影響

pH值對不稀釋酵母培養的影響結果見圖2。由圖2可看出，在一定pH值范圍內，隨著pH值的升高，酵母細胞數和出芽率逐漸增加，在pH6.0時，分別達到最大值1.38×108個/mL和15.2%，而后下降。由此可以得出，不稀釋酒母培養的最佳pH值為6.0。pH值過低或過高，影響糖化醪中液化酶和糖化酶的使用效果，酵母營養不良，影響培養質量。

2.3 酸性蛋白酶對不稀釋醪酒母培養大生產試驗

為檢驗酸性蛋白酶的實際應用效果，以試驗確定的酸性蛋白酶使用量和pH值，進行生產性酒母罐培養酒母試驗。

在本試驗中，試驗組采用不稀釋糖化醪，調節pH值6.0，添加酸性蛋白酶10 mg/L；對照組采用稀釋糖化醪，不調pH值，營養鹽為尿素和磷酸二氫鉀，培養結果見表3。

表3 車間大酒母罐培養結果

從表3可以看出，試驗組添加酸性蛋白酶進行酒母培養時，細胞數、出芽率和死亡率均明顯優于對照組，酵母細胞數平均可達到對照組的2倍。此外，試驗組傳代11次時，細胞數依然達2.3×108個/mL，而傳統稀醪無機鹽僅培養7代，細胞數就近乎為零。表明在不稀釋醪中加入酸性蛋白酶培養酒母具有更好的效果。

3 結論

3.1 以小麥粉提取谷朊粉后的淀粉乳生產酒精酒母培養中，添加無機營養鹽不能完全滿足酵母的生長需要，而酸性蛋白酶可使小麥淀粉乳中水溶性蛋白分解為酵母細胞可直接利用的短肽和α-氨基氮，可為酵母提供豐富的有機營養源，并顯著促進酵母生長與繁殖。

3.2 試驗結果表明，使用酸性蛋白酶對不稀釋糖化醪進行酒母培養，培養的最佳pH值為6.0，酸性蛋白酶適宜用量為10 mg/L。通過試驗表明，可顯著提高細胞數和出芽率，并且延長酒母傳代次數，這不僅可節約干酵母的使用量，對企業生產上節能降耗等方面也有一定的指導意義。

[1]謝伯達.探索燃料酒精的開發應用[J].福建能源開發與節約,2001(4)：33-34.

[2]趙銀峰.小麥酒精發酵新工藝的研究[D].鄭州：鄭州大學,2005：6-9.

[3]唐勝球,童小英,許梓榮.酒用酸性蛋白酶的研究進展[J].釀酒科技,2005(1)：41-44.

[4]閻致遠,張益慶,廖德勝.酸性蛋白酶生產酒的代謝研究[J].糧食與飼料工業,1995(8)：24-25.

[5]李傳林.應用濃醪發酵技術,推動酒精工業節能及清潔生產[J].釀酒科技,2005(5)：107.