湘鄂地區三葉木通野生資源的ＲＡＰＤ親緣關系分析

李紅英 王曉輝 覃大吉 向極釬１，楊永康１，陳菲菲１，萬海英１，周 敏２，朱 麟１

摘要：采用RAPD分子標記技術對湘鄂地區6個不同區域的野生三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]進行了遺傳多樣性研究。從50個隨機引物中篩選出10個條帶清晰、多態性明顯并且重復性好的引物，共擴增出86條DNA片段，其中73條為多態性條帶，占總擴增帶數的84.9%。利用NTSYS軟件進行聚類分析，以相似系數0.578為標準，可將所有品種分為3類，第Ⅰ大類包括恩施紅廟（紫色型）和湖南古丈（麻色型）;第Ⅱ類包括建始花坪、巴東茶店子和宣恩椒園;恩施太陽河的獨立分為第Ⅲ類。

關鍵詞：三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.];野生資源;RAPD;親緣關系

中圖分類號：Q37? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.035? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]隸屬于木通科木通屬，俗稱預知子、八月瓜，落葉藤木，長可達10 m。多生長于海拔350～1 600 m的山地、山坡、山谷、溪邊、密林或疏林灌叢較陰濕地。分布于長江流域各省以及甘肅、河北等省。小枝褐色或暗褐色，疏生淡黃褐色皮孔;莖枝無毛。三葉復葉，小葉卵形，邊緣具波狀圓齒或淺裂，側脈一般5～6對，頂葉較小，基部偏斜。總狀花序，花單性，暗紫紅色。果為肉質果，橢圓形，稍彎曲，種子多數，扁平卵圓形，黑色。花期5月，果期8—9月。本種果實含有糖類，種子含脂肪油43%。根、藤莖及果實、種子均可入藥。種子可榨油;果實熟后可食用。

RAPD是美國的Williams與Welsh 2個研究小組于1990年同時提出的1種DNA分子標記技術[1，2]。RAPD技術建立在PCR技術基礎上，用一系列（通常數百個）不同的隨機排列堿基序列的寡核苷酸單鏈（一般為8～10 bp）作為引物，對所研究的基因組DNA進行單引物擴增，然后用凝膠電泳分離擴增片段，經染色來顯示擴增DNA片段的多態性，擴增片段多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性[3]。相對于傳統的酶學、RFLP等方法，RAPD標記具有操作快速、簡便、多態性豐富、適應性廣等諸多優點，現已廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因定位，特別是遺傳多樣性的檢測[4]和品種分類、親緣關系鑒定和病毒檢測、優良性狀及抗體篩選等方面[5]。由于RAPD標記技術應用隨機引物，當對大量試驗材料進行研究時，往往首先要對引物進行篩選[6]。為此，試驗以湘鄂6個不同區域的三葉木通為材料，通過RAPD標記技術對50個10堿基的隨機引物進行篩選，以期為應用RAPD標記技術進行三葉木通的遺傳多樣性分析、品種分子鑒別、構建遺傳指紋圖譜及分子標記輔助育種等研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 供試樣品? 供試樣品為2017年收集的湘鄂6個不同地區三葉木通類群的鮮葉，具體信息見表1。

1.1.2? 主要儀器? 高壓蒸汽滅菌鍋（上海東亞容器01J2003-04）、超低溫冰箱（SANYO MDF-392）、冰箱（Hair 208K/ANCINA）、制冰機（SCOTSMAN DA24845-3）、PCR擴增儀（德國Eppendorf 5331）;高速低溫離心機（德國Eppendorf 5417R）、電泳儀（北京六一DYY-4C）、渦旋振蕩器（美國Scientific Industries Vortex-Genie 2）、電子天平（賽多利斯Secura？誖）、凝膠成像系儀器（美國伯樂 Gel Doc 200）、超微量紫外可見分光光度計（北京普析TU-1810）。

1.1.3? 引物及試劑? 試驗所設計的RAPD引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，DNA提取試劑盒、PCR擴增所用試劑購于寶日醫生物技術有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 三葉木通DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extration Kit。取葉片100 mg，液氮研磨后加入500 μL的Buffer HS I和10 μL的50×DTT Buffer混勻，然后加入10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分振蕩混勻，于56 ℃水浴溫育10 min;加入62.5 μL的Buffer KAC（Buffer HS I或Buffer HS II的1/8體積），充分混勻，冰上放置5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清，加入與上清液等體積的Buffer GB，充分混勻，將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至 Spin Column中（由于溶液較多，一般需要分兩次過柱，每次過柱的體積量不要超過700 μL），12 000? ? r/min離心1 min，棄濾液;將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液;將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液（沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽分）;重復上一個步驟;將Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 r/min離心2 min;將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30～50 μL的Elution Buffer或滅菌水，室溫靜置5 min（將? Elution Buffer或滅菌水加熱至65 ℃時使用有利于提高洗脫效率）;12 000 r/min離心2 min洗脫DNA。用超微量紫外可見分光光度計和1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度與濃度。

1.2.2? RAPD PCR擴增? 反應體系總體積25 μL，含有1 μL基因組DNA（30 ng），1 μL引物（5 μmol/L），2.5 μL 10×PCR buffer反應緩沖液，2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.2 μL Taq酶，用ddH2O補充體積至25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，35.5 ℃退火1 mins，72 ℃延伸1 min，38個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物使用1.3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳35 min，在凝膠成像儀上觀察照相、記錄。

1.3? 數據分析

根據各分子在相同電泳遷移率（相同分子量片段）的有無，統計得到所有條帶的二元數據，有DNA擴增條帶記為“1”，無帶記為“0”，利用Ntsys計算出遺傳相似系數、構建聚類圖。

2? 結果與分析

2.1? 三葉木通基因組DNA的提取結果

由圖1可知，提取的DNA經1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，表明DNA質量滿足后續試驗的要求。

2.2? 引物擴增結果

進行引物的篩選也是進行RAPD-PCR擴增的關鍵，本試驗選取了上海生工生物工程技術服務有限公司合成的50種隨機引物進行篩選，在合適的PCR擴增條件下，一些引物如M04、S07、S08、S15、S16無擴增條帶，而S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50擴增譜帶清晰且多態性好擴增范圍廣泛，都在7條帶及以上，所以選取這10種引物用于親緣關系分析（表2）。

2.3? 親緣關系分析

在建立合適的RAPD反應體系的基礎上，從50個10 bp隨機引物中選用最好的引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50用于正式擴增，對6個供試的三葉木通葉片基因組DNA擴增出10張指紋圖譜，共獲得86條DNA譜帶，其中73條多態性帶，占總擴增帶數的84.9%，每個引物擴增的帶數在7～11條，平均為8.6條，擴增出的DNA片段大小在100～1 000 bp，表3為所選的10種引物擴增結果。

圖2至圖11為引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50的RAPD擴增圖譜。10個指紋圖譜綜合分析結果表明，湖南古丈與恩施太陽河、宣恩椒園的共同點位很少，擴增的條帶少，它們的親緣關系較遠，而恩施紅廟與湖南古丈、建始花坪與巴東茶店子的擴增帶的相似性很大且譜帶清晰，所擴增的片段都在100～1 000 bp，它們的親緣關系較近。

2.4? 遺傳相似性分析

利用RAPD標記擴增DNA片段，通過Ntsys計算出遺傳相似系數（GS）。RAPD標記揭示的6個地區三葉木通資源間的遺傳相似系數為0.434 1～0.682 9（表4），平均值為0.558 5。其中建始花坪（JS）與巴東茶店子（BD）GS值最大，為0.682 9，湖南古丈（HN）與恩施太陽河（TYH）GS最小，為0.434 1。

2.5? 聚類結果分析

由圖12可知，以相似系數0.578為標準，可將6個不同區域的三葉木通分為3大類，第Ⅰ大類包括恩施紅廟自選品種紫色型（ES）和湖南古丈麻色型（HN），它們之間的基因組差異不是很明顯，這很可能是由于自選品種恩施紅廟紫色型多年來對湖南古丈三葉木通進行的品種選育和野轉家栽培造成的;第Ⅱ類包括宣恩椒園（XE）、巴東茶店子（BD）和建始花坪（JS）;恩施太陽河（TYH）獨立分為一類。

3? 小結

RAPD標記技術是出現最早的分子標記技術之一，其操作簡便、成本較低及不需要DNA的序列材料等特點是其他標記技術無法比擬的[7]。但RAPD標記也存在某些不足，其中最主要的是其靈敏度高，受反應條件影響較大，檢測的重復性較差，因此，研究者在利用RAPD標記技術進行遺傳多樣性分析時一定要嚴格控制試驗條件，采用穩定優化的反應體系方能取得理想的試驗結果[8]。同時，在運用RAPD標記技術時，由于每個隨機引物并不適合于所有物種，因此對引物的篩選是非常必要的，篩選出多態性豐富、穩定性好的隨機引物是整個試驗成功的關鍵[9]。

田宗城等[10]以七葉木桶、三葉木通、白木通、五葉木通等4個種的12個材料為研究對象，用RAPD技術對其進行親緣關系分析，從40個隨機引物（10mer）中篩選出5個（S30、S168、S11、S12、S96），對所有供試材料進行擴增，共獲得5張指紋圖譜，共在52個位點上擴增出條帶，平均每個引物擴增10.4個，多態位點43個，占總帶數的82.7%。而本試驗以湘鄂地區6個不同區域的三葉木通為供試材料，更為系統地分析了三葉木通遺傳多樣性，從50個隨機的RAPD引物中成功篩選出10條多態性豐富、條帶清晰且可重復性好的有效引物，10條引物共擴增出83條DNA條帶，其中84.9%為多態性條帶，這為應用RAPD標記技術快速、準確地進行三葉木通遺傳多樣性分析和品種分子鑒別等研究奠定了良好基礎。

三葉木通分布于中國河北、山西、山東、河南、陜西南部、甘肅東南部至長江流域各省區。可見它分布遍布全國各地，樣品采集應該來源于全國各地，而試驗不足之處在于樣品采集的局限性，只收集了鄂湘6個不同區域，對三葉木通遺傳多樣性的研究不是很全面，但是卻為三葉木通種子資源的篩選與開發利用奠定了一定的基礎。

參考文獻：

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[10] 田宗城，李? 峰，王文龍，等.木通屬植物的RAPD研究[J].湖南文理學院學報（自然科學版），2005，17（2）：40-42.