上中下通用痛風湯對痛風性關節炎模型TLR4信號通路的影響

李 欣，柴晶美，楊阿龍，馬怡軒，周麗雅

（長春中醫藥大學基礎醫學院，長春 130117）

痛風性關節炎（GA）屬于代謝性骨關節疾病，是由于機體對嘌呤類物質代謝發生障礙，導致的血尿酸濃度過高，尿酸鹽結晶沉積導致以關節炎癥反應為主要表現的一種疾病[1-2]。上中下通用痛風湯是由金元四大家之一朱丹溪所創制，出自《丹溪心法·痛風》，上中下通用痛風湯具有宣暢氣機、清熱化痰、活血行瘀、通絡止痛之功效。本課題組前期研究發現上中下通用痛風湯具有抗炎鎮痛作用[3-5]，可降低關節腫脹程度，降低炎癥因子表達，本研究將以TLR4/ NF-kB信號通路為切入點，分析上中下通用痛風湯抗炎鎮痛機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠 60 只，雄性，體質量（200±20）g，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，許可證號SYXK（吉）2013－0005。

1.2 藥物與試劑 上中下通用痛風湯組方：酒炒黃柏、蒼術、天南星各60 g，桂枝、威靈仙、羌活各9 g，防己l.5 g，桃仁、白芷各15 g，龍膽草1.5 g，川芎60 g，炒神曲30 g，紅花4.5 g。按常規方法煎煮后濃縮至生藥1 g/mL， 4 ℃冰箱冷藏備用。吲哚美辛片（上海信誼萬象藥業股份有限公司）；尿酸鈉（美國 Sigma），SP試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），TLR4、MYD88抗體（美國BD）。奧林帕斯光學顯微鏡BX51。

1.3 動物分組、給藥及造模 清潔級SD大鼠 60 只，雄性，體質量（200±20）g，隨機均分為6 組：正常對照組，模型組，吲哚美辛組（5 mg/kg），上中下通用痛風湯高（20 g/kg）、中（10 g/kg）、低（5 g/kg）劑量組，正常對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，上中下通用痛風湯組灌胃給藥，1 次/d，連續7 d，末 次 給 藥1 h后，按Coderre[6]經典方法制備急性痛風性關節炎模型。空白對照組左踝關節注射等體積的生理鹽水。

1.4 檢測大鼠踝周徑變化值 在受試踝關節相同部位于造模前及造模后6、12、24、48 h，用軟尺測量受試踝關節周長，觀察造模前后受試大鼠關節周長的變化。

1.5 滑膜組織形態學檢測 取各組大鼠左踝關節，多聚甲醛溶液固定 24 h，脫鈣 1 周；脫鈣后進行常規脫水，石蠟包埋，經髁突矢狀面以5 μm厚度低溫連續切片，蘇木精-伊紅 （HE）染色，光學顯微鏡下觀察上中下通用痛風湯對痛風性關節炎模型關節病理組織形態學變化。

1.6 滑膜組織TLR4、NF-κB檢測 采用SP免疫組織化學法檢測各組大鼠關節滑膜TLR、NF-κB蛋白表達情況。實驗步驟按照說明書要求進行，染色結果為褐色的表示TLR4、MYD88陽性表達。 采用平均吸光度值反映TLR4、NF-κB陽性表達的強度，每例標本的被檢區測 3張切片，采用 Image-Pro Plus 6.0 形態學圖像分析系統進行分析。

1.7 統計學方法 數據采用統計軟件 SPSS 19.0進行分析， 結果以均數±標準差（）表示， 兩組間比較進行t 檢驗，多組均數間比較采用方差分析， 以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 上中下通用痛風湯對尿酸鈉致大鼠踝周徑的影響 與空白對照組比較，痛風性關節炎模型組大鼠造模后6、12、24、48 h不同時間點大鼠踝周徑均顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較， 上中下通用痛風湯高劑量組大鼠在造模后隨著時間延長大鼠踝周徑均顯著降低（P＜0.05）；上中下通用痛風湯中劑量組及吲哚美辛組大鼠在造模后大鼠踝周徑也顯著降低（P＜0.05），踝周徑的動態變化見表1。中藥中劑量組和吲哚美辛組相比無統計學意義，吲哚美辛組與中藥高劑量組比較有統計學意義（P＜0.05），結果提示上中下通用痛風湯和吲哚美辛均能緩解大鼠關節腫脹，中藥高劑量組優于吲哚美辛組。

表1 上中下通用痛風湯對大鼠踝周徑的影響（，n = 10）

表1 上中下通用痛風湯對大鼠踝周徑的影響（，n = 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△ P＜0.05；與吲哚美辛組比較，▲ P＜0.05

組 別踝周徑變化6 h 12 h 24 h 48 h對照組 1.267±0.065 1.146±0.053 1.133±0.060 1.137±0.030模型組 1.739±0.369# 1.598±0.225# 1.475±0.390# 1.393±0.175#吲哚美辛組 1.545±0.136△ 1.497±0.128△ 1.407±0.146 1.206±0.180高劑量組 1.464±0.205△▲ 1.390±0.101△▲ 1.243±0.130△▲ 1.163±0.120△▲中劑量組 1.510±0.230△ 1.460±0.140△ 1.355±0.240△ 1.220±0.220△低劑量組 1.564±0.180△ 1.479±0.320△ 1.380±0.140△ 1.260±0.130△

2.2 各組大鼠踝關節滑膜組織病理觀察 空白對照組 大鼠關節表面被覆透明軟骨，關節囊腔光滑，結構層次清晰，未見滑膜腫脹、炎細胞浸潤。模型組大鼠關節滑膜可見中度充血水腫、腫脹，伴有大量炎細胞浸潤，滑膜細胞變性壞死，輕度增生。上中下通用痛風湯組可見關節滑膜較平整、輕度充血水腫。病理觀察顯示上中下通用痛風湯具有改善踝關節炎細胞浸潤、滑膜組織破壞、血管擴張及充血功能。

2.3 上中下通用痛風湯對大鼠關節滑膜組織TLR4、NF-κB表達的影響 結果顯示對照組大鼠踝關節滑膜組織中TLR4與NF-κB染色陽性區域較少，提示上中下通用痛風湯可降低痛風性關節炎模型大鼠關節滑膜TLR4與NF-κB蛋白表達。見表2。

表2 各組大鼠踝關節組織中TLR4、NF-κB表達的IOD/area值比較（，n = 10）

表2 各組大鼠踝關節組織中TLR4、NF-κB表達的IOD/area值比較（，n = 10）

注：與對照組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

組 別 TLR4 NF-κB對照組 0.235±0.004 0.31±0.035模型組 0.35±0.030# 0.45±0.120#吲哚美辛組 0.265±0.020△ 0.37±0.110△高劑量組 0.245±0.016△ 0.295±0.075△中劑量組 0.253±0.006△ 0.368±0.085△低劑量組 0.073±0.023△ 0.394±0.053△

3 討論

痛風是屬于機體嘌呤代謝紊亂所致的一類代謝性疾病，由于尿酸鈉結晶在關節周圍組織沉積而引起的急性炎癥反應，其中炎癥因子如IL-6、IL-1 、TNF-α、IL-8等參與痛風性關節炎的發生發展[7]。TLR4可識別作為機體內源性損傷相關分子模式的尿酸鈉，啟動其下游信號通路，誘導炎癥因子合成并釋放。有研究[8-13]發現，TLR4缺陷的小鼠關節炎的嚴重程度明顯減輕。本課題組前期研究發現上中下通用痛風湯具有抗炎鎮痛作用，可降低 IL-1、TNF、IL-6 等多種炎癥因子的表達水平，對急性痛風性關節炎有較好的治療效果。本研究以TLRs/NF-κB信號通路為切入點探討上中下通用痛風湯抗炎鎮痛作用，揭示其作用機制。

本實驗研究發現，TLR4與NF-κB表達升高，伴有大鼠關節腫脹程度明顯升高，而經上中下通用痛風湯治療后，結果顯示，TLR4與NF-κB表達下降，并伴有大鼠關節腫脹程度的降低，關節炎癥顯著改善，提示尿酸鈉晶體可能通過被TLR4識別，并啟動TLR4/NF-κB信號通路，進而加重急性痛風性關節炎大鼠關節組織的炎癥反應。本實驗結果提示，TLR4/NF-κB信號通路在急性痛風性關節炎發生發展中發揮重要作用，上中下通用痛風湯可通過調節TLR4/NF-κB信號通路發揮治療作用，但其機理還有待進一步研究。

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