益母草藥材中鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定

陳 茜

（錦州市婦嬰醫(yī)院中藥局，遼寧 錦州 121000）

益母草（Leonurus heterophyllus[1]），是一年或者兩年生草本唇形科植物。味辛苦、性涼。作用活血祛瘀、利尿消腫，用于調(diào)節(jié)女性的月經(jīng)和緩解痛經(jīng)，還可治療胎漏難產(chǎn)、產(chǎn)后惡露不止、尿血以及便血等癥。益母草有多種化學(xué)成分，包括生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等。其中主要的有效成分為生物堿，即為益母草堿 （leonurine，leo）、水蘇堿 (Stachydrine，sta)、益母草啶和益母草寧等。其中鹽酸水蘇堿為益母草藥材中的主要活性生物堿，本文主要采用了薄層層析法來(lái)對(duì)益母草藥材中鹽酸水蘇堿的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器 雙波長(zhǎng)薄層色譜掃描儀CS-930(日本島津)[2]；臥式層析槽；恒溫水浴鍋；噴霧器；微量定量毛細(xì)管；平整干凈的玻璃板；烘箱；研缽；量筒。

1.2 材料和試劑 益母草藥材；羧甲基纖維素鈉 (CMC）的水溶液；由海洋化工廠提供的硅膠G(青島)；來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所的鹽酸水蘇堿（產(chǎn)品批號(hào)：110713-203116）；其他的試劑都是AR級(jí)的分析純。

1.3 薄層色譜法的層析條件與顯示劑 展開(kāi)劑的配制是將正丁醇-鹽酸-醋酸乙酯按4∶1.5∶0.5的比例配好，且先倒入臥式層析槽中，蓋上表面皿，以待之后實(shí)驗(yàn)使用。顯色劑則選用稀碘化鉍鉀試液。

1.4 研究方法

1.4.1 薄層色譜的制備 將羧甲基纖維素鈉 (CMC）的水溶液與硅膠G混合于研缽中，緩慢加入適量的水研磨，直至成糊狀后取出，并均勻地平鋪在玻璃板上，鋪板時(shí)可輕敲玻璃板以使其涂布均勻，整個(gè)平鋪面要求無(wú)氣泡，無(wú)疙瘩，特別是邊角的部分必須涂布均勻。完成鋪板后，在干凈平整的陰涼處晾干，再放入烘箱烘干，約30 min后拿出，備用。

1.4.2 益母草供試品溶液和鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液的制備 取出益母草藥材適量，研磨一定時(shí)間，使其成粉末狀，再精密稱定該細(xì)粉大約1 g并通過(guò)二號(hào)篩。將篩選后的粉末放置于錐形瓶中，向瓶中加入50 mL的99.7%乙醇試劑，然后將其加熱回流1.5 h，再放冷、濾過(guò)。濾過(guò)后的濾渣及容器需用50 mL的EtOH分3次洗滌，之后濾過(guò)、再合并濾液，再放到恒溫水浴鍋中蒸干。蒸干后的殘?jiān)尤胧蛊淙芙獾腅tOH適量，再轉(zhuǎn)移到10 mL的量瓶中，然后同樣用EtOH稀釋至刻度并搖勻，放于離心機(jī)中以5000 r/min的速度離心5 min，最后取其上清液作為實(shí)驗(yàn)所需的供試品溶液。精密吸取2 μL（1）與4 μL（2） 的供試品溶液。

精密稱取出適量的鹽酸水蘇堿對(duì)照品，再加入E－tOH制備成每1 mL中含有2 mg的鹽酸水蘇堿的溶液作為實(shí)驗(yàn)用的對(duì)照品溶液[4]。(對(duì)照品溶液實(shí)際的濃度為 (C=2.04 mg/mL)。精密吸取對(duì)照品溶液1 μL(a)、2 μL(b)、4 μL(c)、6 μL(d)、8 μL(e)。

用微量定量毛細(xì)管分別蘸取益母草供試品溶液和鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液，于不同硅膠G薄層板的原點(diǎn)（距層析板下端2.0 cm處，斑點(diǎn)間距為1 cm） 上點(diǎn)樣，并作好供試品與對(duì)照品的標(biāo)記。點(diǎn)樣完畢再放入臥式層析槽中層析，直至展開(kāi)劑上升到距上邊沿0.5～1 cm時(shí)，立即取出硅膠G板，此時(shí)若斑點(diǎn)較為模糊，可用稀碘化鉍鉀試液噴濕以顯色，用薄層色譜儀CS-930掃描測(cè)定[4]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 對(duì)照品溶液1 μL(a)、2 μL(b)、4 μL(c)、6 μL(d)、8 μL(e) ，所得峰面積值如表1所示。建立坐標(biāo)曲線，對(duì)照品溶液的點(diǎn)樣量設(shè)置為橫坐標(biāo)，峰面積設(shè)置為縱坐標(biāo)。所得的線性回歸方程為：y=22389.1x+8129.8，r=0.9994。結(jié)果表明該藥材的鹽酸水蘇堿在2.3～16.4 μg范圍內(nèi)的濃度與峰面積擁有良好的線性關(guān)系[5]。

表1 對(duì)照品溶液峰面積值

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 分別吸取6份對(duì)照品溶液2 μL，其次在同樣的硅膠G薄層板上點(diǎn)6個(gè)點(diǎn)，按上述方法測(cè)定，其峰面積積分值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.8% (n=6)，證明此方法精密度較為良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用的同一塊硅膠G薄層板上的同一斑點(diǎn)進(jìn)行掃描測(cè)定，每小時(shí)1次，共測(cè)定5次計(jì)算的峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD=1.58%，（n=5），結(jié)果表明斑點(diǎn)穩(wěn)定性較好。

2.4 重現(xiàn)性性試驗(yàn)結(jié)果 取同一樣品，按照上述供試品溶液的制備方法制成5份，按上述測(cè)定方法分別依法測(cè)定，所得的結(jié)果RSD=1.93%，結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性好。

2.5 樣品含量測(cè)定結(jié)果 先精密吸取4 μL的供試品溶液，2 μL與4 μL的對(duì)照品溶液按上述方法測(cè)定，用薄層掃描法來(lái)對(duì)其進(jìn)行掃描，在波長(zhǎng)為λs=510 nm時(shí)，可測(cè)量供試品吸光度積分值和對(duì)照品吸光度積分值[6]，再用兩點(diǎn)法計(jì)算，即得供試品的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品溶液含量測(cè)定結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)及結(jié)果 在此采用加樣回收法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，首先在已知含量的益母草藥材中加入鹽酸水蘇堿的對(duì)照品適量，即加入對(duì)照品貯備液1 mL，再按含量測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 益母草藥材的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版的益母草含量測(cè)定法是以比例為1∶8∶3的乙酸乙酯-正丁醇-鹽酸的混合液為展開(kāi)劑，再以稀碘化鉍鉀試液與三氯化鐵乙醇溶液 (10∶1)的混合溶液作為顯色劑[7]，應(yīng)用該方法在此藥材上實(shí)驗(yàn)后，所表現(xiàn)出來(lái)的分離效果較差。再用雙波長(zhǎng)掃描法來(lái)替代《藥典》的單波長(zhǎng)掃描法后，明顯提高了結(jié)果的精確性。2010版的《中華人民共和國(guó)藥典》測(cè)定益母草中鹽酸水蘇堿含量是采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)的方法[8-9]。該方法需采用氨基色譜柱，流動(dòng)性則選用比例為90∶10的乙腈-水的混合液，此外還需采用硅藻土拌樣甲醇回流提取法提取，并制備成供試品溶液，該法操作上相對(duì)簡(jiǎn)捷。但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器有著較大的局限性——為避免不揮發(fā)物沉積在加熱室及光學(xué)檢測(cè)池體中，它的流動(dòng)相要求全部蒸發(fā)。所以，只能使用揮發(fā)性的化合物來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，例如氨、醋酸和三氟乙酸等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此次實(shí)驗(yàn)選用的展開(kāi)系統(tǒng)有較好的分離度，且所得斑點(diǎn)較為清晰；此方法簡(jiǎn)便易行，測(cè)定的含量結(jié)果比較穩(wěn)定。且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用儀器試劑及操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)便易行，可用該方法快速檢測(cè)該藥材。

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