環境中五氯酚對水生生物的毒理學研究進展

熊 楠，姚小珊，周秀花，金士威

中南民族大學化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074

五氯酚（pentachlorophenol，PCP）是目前普遍使用的有機氯化合物，肉眼觀察其為白色針狀晶體，稍稍加熱時有刺激性酚臭味，難溶于水，被大量用做防腐劑和殺蟲劑，PCP在水環境中性質較穩定，生物降解緩慢，并且不完全，美國環保署［1］將PCP列為優先污染物。諸多研究已經表明PCP會對水生生物具有氧化損傷、急性毒性、內分泌干擾、遺傳毒性、細胞毒性［2-3］及發育毒性等［4］。在我國，PCP是殺滅釘螺的主要藥物之一，PCP的濫用將導致土壤、水源甚至于動植物的污染，最終PCP還將通過食物鏈進入人體，對人類健康將造成不可忽視的危害，國際癌癥研究機構已將PCP列為第2B組致癌物［5］。2008年，國家環保局將PCP列為“高污染、高環境風險”產品［6］。

PCP主要來自工業廢水，如除草劑、木材、防腐劑、生產廢水以及噴灑除草劑后的農田退水。并且受污染土壤引起的地下水中也含有PCP，還可以通過水環境中其它氯代有機物好氧型生物降解產生PCP，最終這些受污染水體都流入水環境，PCP在水體中將對水生生物產生直接的危害，因此，PCP在水環境中的分布情況及其對水生生物的毒性效應一直是人們關注的熱點。關于PCP對水生生物的毒理學研究，國內外已經發表了一些相關文章［7-10］，本文總結了PCP對水生生物毒理學研究的相關研究進展，并對今后進一步的探究做出了展望。

1 概 述

1.1 水環境中PCP的分布

PCP已經成為典型的持久性有機污染物（per?sistent organic pollutants，POPs）的一種，在水環境中PCP污染普遍存在。Zheng等［11］為了研究PCP在不同地區的污染情況，對水環境中PCP的濃度及分布狀況做了調查和研究，研究結果顯示在20世紀70年代這個時期，西方大部分國家的水環境中PCP含量都較高，但是在20世紀末期這些國家的水環境中的PCP含量開始逐漸的下降，這都是源于各個國家對PCP使用禁令的頒布。與這些國家相反的是，我國的地表層水和沉積物中的PCP的濃度依然在逐年升高。洞庭湖位于中國南部，湖面總面積約2 740 km2。湖深平均約6 m～7 m，最深的湖達31 m。這是中國淡水魚的重要來源。然而，血吸蟲在這個地區長期存在。1960年為了控制通過釘螺傳播的血吸蟲病，噴灑了大量的五氯酚鈉（Na-PCP）。據估計，在該地區使用至少9.8×106kg的Na-PCP，洞庭湖中PCP的含量曾高達 103.7 μg/L［12］。盡管如此，自 1996 年以來，這一地區釘螺有減少，血吸蟲病得到一定程度上的控制，但仍有大量Na-PCP、PCP分布在湖泊環境中并積累在沉積物中［13］。PCP及其衍生物的持久性導致湖泊嚴重污染。胡建英等［14］對海河流域以及渤海灣水體和沉積物中PCP的污染狀況展開了調查，研究發現海河流域和渤海灣水體PCP濃度范圍分別為0 μg/L～1.8 μg/L和0 μg/L～0.3 μg/L，而在沉積物中PCP的質量濃度分別為0 ng/g～13.7 ng/g和0 ng/g～0.04 μg/kg。有研究表明，長江流域曾長期使用PCP殺滅釘螺，長江南京段沉積物中PCP含量為 0.49 μg/kg～4.57 μg/kg［15］。在中國珠三角，河流沉積物中PCP的平均含量為7.93 ng/g。研究發現，中山魚塘沉積物中PCP含量最高（平均約為37.5 ng/g），其次是東莞（平均21.1 ng/g），在深圳（平均約3.69 ng/g）和順德（平均約2.20 ng/g）則較少［16］。

1.2 PCP在水生生物體內的蓄積

PCP具有較高的生物蓄積性，難降解，水環境中殘留的PCP將大量富集在水生生物體內，PCP及其Na鹽可以經過生物體表層肌膚、呼吸道、消化道吸收，在生物體的肝、腎中含量較高，在脂肪、肌肉和腦中的含量較少。因此，PCP在水生生物體內的濃度可以直接反映水環境受PCP的污染情況。生物富集系數（bioconcentration factors，BCF）用來表示污染物在生物體內的生物富集作用的大小，是描述污染物在生物體內累積趨勢的重要指標。Tachikawa等［17］將淡水青鳉魚和海水青鳉魚暴露在一定濃度的PCP中，結果顯示淡水青鳉魚和海水青鳉魚的BCF值分別為1 680和370，該研究發現鹽度可以影響PCP在青鳉魚體內的富集大小。Kondo等［18］研究發現青鳉魚體內的PCP濃度與其在水環境中的濃度呈負相關，魚體內的PCP濃度隨其在水環境中的降低而增加，同時，他們的研究也發現PCP在魚體中累積能力較2，4-DCP（2，4-二氯苯酚）和2，4，6-TCP（2，4，6-三氯酚）更高，且PCP對青鳉的BCFs值隨著水體的pH的增大而減小。據報道，當水體中pH從9降低到5.5時，金魚體內PCP的生物富集因子從10增加到125［19］。因此，在評估PCP對水生環境的不利影響時，必須考慮水的pH值。研究發現暴露在含PCP水溶液中48 h后，鯽魚膽囊對PCP的富集系數高達11 365。PCP會在草魚膽汁內大量積累，并且90%以上為結合態，暴露時間越長，PCP濃度增加，48 h殘留量達到 904 mg/kg，BCF 為 6 027［20］。在 2003 年至 2004年期間，Ge等［21］在江蘇省收集的 55種魚，蝦，螃蟹，青蛙和海龜等樣品，測定樣品體中PCP濃度。PCP濃度范圍從小于方法檢測限（method detec?tion limit，MDL）0.5 μg/kg 至 61 μg/kg（以單位濕重計），江蘇省55個樣本PCP濃度平均值為5.2 μg/kg。許曉國等［22］研究了江蘇常州市金壇區的魚塘，發現在使用過PCP的水體中，PCP在魚肉中平均殘留度為 0.22 μg/kg，最高為 0.35 μg/kg（以單位干重計），在魚膽汁中平均殘留度為94.19 μg/L，最高達167.30 μg/L，高于沒有使用過PCP的魚塘魚肉和膽汁中PCP的殘留度。

2 PCP對水生生物的作用機制和毒性效應

2.1 氧化損傷

目前，關于PCP對水生生物的氧化損傷毒性效應研究有很多，利用PCP引起的機體生化效應的改變作為敏感的生物指標（生物標志物），來評價PCP毒性，從而進一步為環境監測，提供科學依據。李偉民等［23］以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，r-gluta?myl cysteingl+glycine，GSH）、一氧化氮合成酶（ni?tric oxide synthase，NOS）、丙 二 醛（malondialde?hyde，MDA）等為生物指標，研究了PCP對鯽魚肝臟的氧化損傷，在暴露低濃度（0.016 mg/L）的PCP溶液15 d后，觀察發現在鯽魚肝細胞中MDA含量提高，SOD活性和GSH含量均降低，表明PCP造成了鯽魚肝臟的氧化損傷效應。類似的，張民等［24］通過細胞體外毒性實驗，發現PCP對鯽魚血液淋巴細胞會造成毒性影響，在PCP濃度為500 μg/L、1 000 μg/L分別暴露，暴露結果發現乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）相對釋放量顯著性增加，LDH釋放量與五氯酚濃度及暴露時間呈正相關，LDH可作為研究PCP對鯽魚細胞毒性的指標。一些實驗室為研究PCP對肝細胞氧化損傷和凋亡的影響，采用鯽魚肝細胞原代培養模型，實驗結果表明PCP使得鯽魚肝臟細胞MDA含量上升的同時也會導致鯽魚肝細胞中GSH含量發生下降，細胞內ROS（活性氧，早已被認為是破壞代謝的副產物）顯著增加，這表明了PCP會通過影響活性氧ROS的含量來誘導肝臟細胞出現凋亡［25］。王輔明等［26］為篩選檢測低濃度五氯酚對水生生物毒性效應較敏感的指標，研究了PCP對鮈鯽的SOD、GSH、熱激蛋白（heat shock protein，HSP）70活性的影響。在相同暴露時間下，隨著PCP暴露濃度的不斷增大，SOD的活性呈現出先受抑制后被激活的趨勢，GSH和HSP70的含量則無明顯變化；在相同暴露濃度下，SOD的活性隨PCP暴露時間的延長也表現為開始被激活后又被抑制的趨勢，GSH和HSP70的含量則無明顯變化。所以，低濃度PCP暴露下與GSH、HSP70的含量相比，SOD的活性更好地反映了PCP對鮈鯽幼魚的氧化損傷效應，說明SOD的活性可作為評價低濃度PCP對水生生物毒性效應的指標。Luo等［27］利用電子順磁共振技術，發現鯽魚在PCP暴露后可以誘導鯽魚肝臟內產生羥基自由基，并且PCP濃度與羥基自由基之間存在濃度效應關系，在0.05 mg/L PCP染毒7天后，谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值與對照組相比有明顯下降趨勢，說明PCP可以導致鯽魚體內產生氧化應激反應。房彥軍等［28］通過蛋白質組學的研究發現，存在39個差異表達蛋白可能與PCP肝臟毒性效應有關的，并應用質譜鑒定技術（mass spectrometry，MS）對其中18個差異蛋白進行了鑒定。這些差異蛋白主要體現在脂類代謝與轉運、線粒體能量代謝和氧化應激等生物學過程當中，這些蛋白都能作為稀有鮈鯽肝臟毒性效應的標志物。

2.2 急性毒性效應

PCP屬于環境激素類物質［29］，對大多數魚類，PCP都有很強的毒性。例如，Johnson等［30］研究表明PCP對斑點叉尾鮰、虹鱒、太陽魚、黑頭軟口鰷、大馬哈魚的96h半數致死濃度（LC50）分別為68 μg/L、52 μg/L、32 μg/L、205 μg/L 和 68 μg/L。Min 等［31］研究發現，PCP對細鱗斜頜鲴和青魚的96 h的LC50值分別為 0.09 mg/L 和 0.10 mg/L。洪華嫦等［32］研究了不同質量濃度的PCP對斜生柵藻的毒性效應，結果表明在暴露 24 h，48 h，72 h，96 h和 120 h后PCP對斜生柵藻的半最大效應濃度（EC50）分別為0.883 mg/L，0.283 mg/L，0.225 mg/L，0.168 mg/L 和0.192 mg/L，并且PCP質量濃度越高斜生柵藻生長受抑制程度越強，當PCP的質量濃度超0.50 mg/L時，斜生柵藻的生長基本完全受到抑制。2005年，鄭敏等［33］用PCP染毒斑馬魚來進行胚胎發育毒性效應研究。研究結果顯示PCP對發育不超過6 h的斑馬魚胚胎具有明顯的抑制效應，可以導致胚胎畸形發育甚至是發育終止。斑馬魚胚胎的致死效應敏感強度隨著PCP對發育48 h斑馬魚胚胎作用時間的增長而增大。其中，LC50值最小的是0 hpf（hours past fertilization，hpf）組，為70.8 μg/L；LC50值最大是 24 hpf組，為831.8 μg/L。潘建林等［34］研究發現PCP對小蝦的24 h和48 h的LC50分別為80 mg/L和67.5 mg/L，并且PCP對大蝦的24 h和48 h的LC50分別為750 mg/L和500 mg/L。有研究報道，五氯酚對花翅羽搖蚊幼蟲96 h及10 d的LC50分別為 20.6 mg/kg和 12.5 mg/kg［35］。

2.3 內分泌干擾

PCP的激素作用影響水生生物的繁殖、發育和生長，并且PCP不易被氧化，易富積在生物體內，對水生生物具有很強內分泌干擾效應，會導致水生生物生長畸形，并影響后代繁殖及發育［36］。

2.3.1 生殖毒性 佟鈺杰等［37］進行PCP對大型溞蛻皮影響的實驗，來研究PCP的環境激素作用，結果表明PCP可抑制大型溞的蛻皮過程，使大型溞蛻皮時間延長。0.01mg/L PCP染毒大型溞48 h，攝食率會受到顯著的抑制［38］。有研究發現，如果將離體培養的斑點叉尾鮰肝臟細胞暴露于PCP中，卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG）在雄魚肝臟細胞中的表達將會增加，這個研究發現表明了PCP可能具有潛在的內分泌干擾效應［39］。類似的研究還有，如對日本青鳉進行PCP染毒試驗，經過28 d暴露試驗，日本青鳉體內的芳烴受體活性、雌激素受體活性以及繁殖行為都會受到PCP的影響。在200 μg/L PCP以下濃度暴露28 d后，日本青鳉雌魚血液中的VTG含量水平和雌魚的產卵量均有所降低，而雄魚血液中VTG明顯提高［40］。Zha等［40］研究發現PCP染毒日本青鳉能引起雌激素受體和芳香烴受體激活一致的效應，將100 μg/L PCP染毒超過2周時，雌性青鳉的產卵能力和平均繁殖力會發生顯著下降，在F1代時，200 μg/L PCP影響了后代的孵化率和孵化期，會造成了嚴重的生殖損害。研究發現，在0.01 mg/L PCP暴露下，青魚生長率為52.0%，與對照組相比其生長率稍有減小，但并無顯著性的差異。當暴露濃度增加到0.02 mg/L PCP時，其生長率明顯下降到42.5%，當暴露濃度最高達到 0.08 mg/L PCP 時，其生長率僅為 14.2%［41］。

2.3.2 甲狀腺毒性 在20世紀90年代，研究顯示PCP有潛在甲狀腺破壞作用［42］。Schwarz等［43］研究發現，在PCP暴露下，會引起鯉魚體內的甲狀腺激素（T3和T4）水平產生顯著的變化，激素含量水平的變化會干擾到鯉魚的甲狀腺內分泌系統。研究進一步發現，相比于T4，PCP與甲狀腺轉運蛋白TTR更易結合，PCP的這種結合能力會導致到達靶器官和靶細胞的甲狀腺激素水平降低［44］。Schuur等［45］研究發現，PCP會對脫碘磺基轉移酶的活性產生影響，其作用機理是通過抑制碘甲狀腺原氨酸的硫酸化，對甲狀腺激素的正常代謝產生影響。有研究發現，慢性暴露于低濃度PCP的水環境中會改變斑馬魚血漿甲狀腺激素水平，以及下丘腦-垂體-甲狀腺軸和斑馬魚肝臟中甲狀腺激素信號傳導和代謝相關基因的表達，導致斑馬魚發育異常［46］。

2.4 遺傳毒性

有研究發現，在PCP暴露下，PCP會造成鯰魚染色體出現結構性損傷，例如染色單體呈現出斷裂、偏離中心、環狀以及非整倍構造。這表明PCP對水生生物有一定的遺傳毒性作用［47］。Pavlica 等［48］利用微核法研究PCP分別對鸚鵡螺蝸牛和斑馬貽貝的基因毒性時發現，PCP可以造成鸚鵡螺蝸牛和斑馬貽貝非常明顯的微核率。并且，當PCP≥80 μg/L時對斑狀貝 DNA損傷明顯增加［49］。與此同時，Farah等［50］研究證實了PCP和2，4-二氯酚（2，4-Dichlorophenol，即 2，4-DCP）同樣具有遺傳毒性，暴露在這兩種有機污染物中，都會誘導斑點叉尾鮰微核頻率。并且PCP的毒性要高于2，4-DCP。2006年，Zhao等［51］以卵黃蛋白原作為標志物，利用幼年金魚肝細胞原代培養來研究PCP和TCDD（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，四氯二苯并-p-二噁英）的抗雌激素效應。研究發現PCP和TCDD可能會與雌二醇競爭性結合雌激素受體，從而干擾卵黃蛋白原表達，對金魚幼體有顯著的遺傳毒性。并且，采用五氯酚及其鈉鹽對鯉魚腎細胞DNA體內和體外進行染毒實驗發現，處理組尾距、慧尾長、Olive尾距、慧尾長 DNA均高于對照組［52］。馬永鵬等［53］根據PCP對稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA的影響的研究發現，PCP會破壞稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA結構，使其出現斷裂、遷移，并且會明顯損傷其血細胞和肝細胞DNA。研究表明，當暴露于含有PCP水環境中時，PCP的濃度越高，PCP對稀有鮈鯽胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA的誘導性表達影響越大，基因被誘導的程度越大，該結果說明CYP1A基因和p53基因的誘導表達可以作為評價PCP毒性作用的敏感指 標［54］。

2.5 細胞毒性

國內外許多文獻已經表明PCP對水生生物具有細胞毒性。例如，Dimich等［55-57］對鯽魚肝細胞進行體外毒性試驗，將鯽魚肝細胞暴露在低濃度PCP下并觀察不同濃度范圍對鯽魚肝細胞的毒性影響。結果表明，暴露在2.5 μg/L～100.0 μg/L PCP下，PCP對鯽魚肝細胞的活性沒有顯著性的效應，但暴露在 500.0 μg/L～1 000.0 μg/L PCP范圍內時，對肝細胞膜的完整性產生明顯的影響，說明PCP對鯽魚肝細胞具有一定的毒性效應。張民等［58］研究了PCP對鯽魚血液中淋巴細胞毒性作用。結果發現在500 μg/L和1 000 μg/L PCP暴露下，LDH相對釋放量明顯有所增加，這表明PCP破壞了鯽魚血液淋巴細胞的完整性。房彥軍等［59］將稀有鮈鯽肝細胞暴露在PCP中，透射電鏡檢測結果證實，無論是低濃度或高濃度暴露組，肝臟細胞核都產生嚴重損傷，核仁會擴大，線粒體等細胞器遭到嚴重損壞，脂滴大量產生且變大。PCP會顯著抑制稀有鮈鯽肝細胞的正常生長，且會損傷肝細胞DNA，由此可知PCP具有明顯的肝細胞毒性。Waneene等［60］進行了雄性鯰魚肝細胞的體外培養實驗，并利用熒光素二乙酸酯測定（fluorescein diace?tate，FDA）來評估細胞活力，并用Western Blot分析來評估暴露PCP后的卵黃發生素的表達。從該實驗獲得的數據表明PCP的細胞毒性作用有較強的劑量-反應關系。在PCP中暴露48 h后，PCP導致細胞活力降低50%所需的劑量（LD50）計算為1.987 μg/mL。 Constanze 等［61］用 虹 鱒 肝 細 胞（RTL-W1）來評價PCP及其代謝物四氯氫醌（tetra?chlorohydroquinone，TCHQ）體外細胞毒性作用機制，研究發現在一定程度上抗氧化劑（如抗壞血酸和槲皮素）能夠減弱PCP和TCHQ的細胞毒性作用，但特別是在較高的PCP和TCHQ濃度下，抗壞血酸和槲皮素對細胞的不利影響會增大。

2.6 胚胎、子代發育毒性

水生生物體對外部刺激的敏感性在整個生命周期中都有所不同，特別是對于魚類，胚胎和幼魚階段通常是生命周期中最敏感的時期［62］。Owens等［63］通過對青鳉的胚胎發育實驗研究發現，PCP會使得青鳉心血管發育畸形，每顆卵1 250納克的劑量的PCP就能將90%的胚胎致死。劉紅玲等［64］研究了PCP對斑馬魚胚胎發育影響，結果表明在0 hpf和24 hpf染毒試驗，在48 h時五氯酚對斑馬魚胚胎都表現出最大的毒性，濃度越高，胚胎發育受抑制的現象越明顯。類似地，有研究也表明PCP會在大馬哈魚組織中積累，并且能夠影響和改變發育中的胚胎的生理學［65］。鄭敏等［66］采用了斑馬魚胚胎發育技術，對PCP的胚胎進行染毒試驗。結果證實PCP會抑制斑馬魚胚胎發育，會造成胚胎發育的畸形、死亡。Yin等［67］的研究表明在短期低濃度PCP暴露下，斑馬魚胚胎發育會產生畸形、死亡的原因之一，可能是PCP對斑馬魚胚胎發育產生抑制作用，增大了斑馬魚肝細胞中p53基因的點突變率。蔣琳等［68］將斑馬魚作為研究對象，對其進行胚胎發育毒性測試，發現暴露在1 000 μg/L PCP下，斑馬魚胚胎發育顯著受阻，孵化率幾乎為零。熊力等［69］采用稀有鮈鯽的胚胎作為研究材料，觀察在PCP暴露下引起的胚胎發育變化，結果表明在PCP暴露下，稀有鮈鯽胚胎發育會延遲，并造成稀有鮈鯽多種畸形，如：脊柱彎曲、心包囊腫、胚胎卵凝結以及死亡等現象。該研究選擇CYP1A基因和抑癌基因p53作為生物標志物，為進一步在分子水平上探討PCP的胚胎毒性作用機制提供了基礎。Ting等［70］為了探索PCP對早期發育的影響和潛在機制，將斑馬魚胚胎暴露于濃度為0，20 μg/L和 50 μg/L的 PCP，之后又進行了顯微鏡觀察和cDNA微陣列分析。研究結果表明，在胚胎發育初期PCP對斑馬魚胚胎產生類似Warburg效應，受影響的胚胎具有發育遲緩的現象。

2.7 其他

PCP對水生生物還具有免疫毒性、致癌性、致突變性等毒性效應［71］。Chen 等［72］研究發現，在PCP暴露下會降低鯽魚血清中的免疫球蛋白M（IgM）的質量濃度，并產生很強的免疫毒性。這種繼發性效應可能是由于PCP的內分泌干擾效應造成的。近幾年，有關PCP致癌性對哺乳動物的研究比對魚類的研究多，且主要是關于PCP的致癌性和魚類p53基因表達量的相關性研究。Zhao等［73］發現了斑馬魚的p53基因信號通路和人類調控機制類似。徐韻等［74］微核試驗和斑馬魚胚胎發育試驗表明，PCP-Na具有一定的致突變性。聶晶磊等［75］還研究發現PCP對金魚的Na+-K+-ATPase具有抑制作用，且有濃度依賴性，PCP濃度升高，抑制強度加大。Preston等［76］研究了PCP對萼花臂尾輪蟲（B.calyciflorus）的毒性作用，發現急性毒性LC50和繁殖毒性EC50值在靜水條件下分別從738 μg/L和1 082 μg/L減小到在流水條件下262 μg/L和136 μg/L。

3 結 語

綜上所述，PCP是具有POPs特性的化合物，能在水環境中長期殘留，并在水生生物體內大量累積，對生物體產生毒害作用，并最終經食物鏈危及到人類的健康。但目前，有關PCP及其代謝物對水生生物體的毒性效應和危害的研究，主要集中在一些浮游生物及魚類，而對于水環境中底棲生物的研究，較少見到相關報道。有限的研究大多數停留在組織、器官等整體水平，而在細胞水平和分子水平的深入研究有限，其致毒機理與作用機制還有待進一步研究。因此有關PCP的水生態毒理學效應，還有待于進一步研究。本實驗室將以底棲生物如夾雜帶絲蚓及我國特有的鯉科實驗魚種稀有鮈鯽等為實驗模型，進一步研究PCP對水生生物的毒理學效應及作用機制。

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