支氣管哮喘小鼠細胞免疫因子及Th17細胞水平的變化及發(fā)病機制研究

徐靜 金曉潔 繆志海 夏斌 戴元榮

支氣管哮喘是呼吸系統常見的疾病，近年來，發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。支氣管哮喘是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，雖然其發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但研究表明，與環(huán)境因素、遺傳背景和免疫調節(jié)紊亂等諸多因素有關[2]。目前，臨床上對于支氣管哮喘的治療主要選用吸入性糖皮質激素和β2受體激動劑，但長期應用會使患者出現骨質疏松、免疫功能下降等不良反應[3]。因此，探討支氣管哮喘的發(fā)病機制對于提高臨床治療的有效性，降低患者不良反應的發(fā)生均具有十分重要的指導意義。已有研究顯示，在支氣管哮喘的發(fā)病過程中，細胞免疫因子起到了調控、延續(xù)以及級聯放大炎性反應的重要作用[4]。同時，已有研究表明，在支氣管哮喘動物模型中，氣道適應性的產生、調節(jié)均與T細胞的產生密切相關[5]。因此，本研究對支氣管哮喘小鼠細胞免疫因子（IL-4、IL-5和IFN-γ）及輔助性T細胞（Th）17細胞水平（IL-10和IL-17）的變化及發(fā)病機制進行探討，旨在為支氣管哮喘的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇SPF級昆明種小鼠24只，雄性，6～8周，體質量（20±2）kg。采用隨機數字表法分為哮喘模型組和正常對照組各12只。哮喘模型組小鼠平均體質量（20.86±0.79）kg，正常對照組小鼠平均體質量（20.59±0.86）kg，兩組小鼠平均體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑 卵清蛋白（OVA）購自美國Sigma公司，規(guī)格：100mg，批號：Sigma-A5503。IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司。

1.3 主要儀器和設備 美國Wescor離心涂片機（型號：CYTOPRO7620）購自北京艾澤信科技公司；奧林巴斯顯微鏡（型號：BX43）購自上海賴氏電子有限公司；博科超低溫冰箱（型號：BDF-25V270F）、博科垂直流凈化工作臺（型號：BBS-SDS）購自山東濟南鑫澤銘醫(yī)療器械有限公司；臺式高速離心機（型號：TG16-WS/TG16WS）購自長沙市湘儀離心機儀器有限公司；精密恒溫水浴鍋（JHH4A）購自上海冠森生物科技有限公司；超靈活濾片式FilterMax F3多功能酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；25、50、100、200μl賽默飛世爾單道可調移液槍購自山東濟南來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.4 小鼠哮喘模型的建立[6]哮喘模型組小鼠分別于實驗開始當天和第8天腹腔內注入OVA混懸液[含OVA/Al（OH）310mg/g]50μg/次致敏，并于第16天給予霧化吸入含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液30～40ml進行激發(fā)，持續(xù)30～40min，1次/d，連續(xù)7d。正常對照組小鼠則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）和外周血血清的收集及制備 兩組小鼠均在最后一次激發(fā)后24h，眼球取血處死，固定，打開胸腔行氣管插管，對左側主支氣管進行結扎，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）行支氣管肺泡灌洗3次，3～4ml/次，回收率均為80%以上。收集BALF，室溫1200r/min 離心 5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存，備用。外周血通過眼球取血獲得，室溫1200r/min離心5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存。

1.6 BALF中炎性細胞計數 將收集到的BALF采用離心涂片機進行細胞收集，HE染色后，在顯微鏡下進行炎性細胞總數和分類計數。

1.7 細胞免疫因子及Th17細胞水平檢測 采用ELISA法檢測兩組小鼠外周血及BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17水平。所有實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.8 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠行為的比較 正常對照組小鼠行動自如，未見異常。哮喘模型組小鼠致敏后活動少，可見明顯的扭體反應；激發(fā)過程中小鼠精神狀態(tài)欠佳，以俯臥為主，并可見不同程度的頭面部瘙癢，呼吸急促，鼻翼煽動，煩躁不安，腹肌抽搐以及大小便失禁等癥狀。

2.2 兩組小鼠肺組織病理切片HE染色結果的比較正常對照組小鼠肺組織中氣道內纖毛上皮排列整齊，黏膜皺壁未見水腫，結構清晰，支氣管周圍無炎性細胞浸潤，僅可見極少量的杯狀細胞，無明顯黏液分泌，見圖1a。哮喘模型組小鼠肺間質及肺泡腔內可見大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且支氣管周圍已被大量的炎性細胞浸潤，氣道上皮組織結構紊亂，其內可見大量杯狀細胞增生，大量黏液分泌并形成黏液栓，相對陽性著色面積增大，見圖1b。

圖1 兩組小鼠肺組織病理切片（a：正常對照組小鼠肺組織；b：哮喘模型組小鼠肺組織；H E染色，×200）

2.3 兩組小鼠BALF中炎性細胞分類計數的比較 與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞分類計數均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠B A L F中炎性細胞分類計數比較

2.4 兩組小鼠BALF和血清中細胞免疫因子表達水平的比較 與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠B A L F和血清中細胞免疫因子表達水平的比較

2.5 兩組小鼠BALF和血清中Th17細胞水平的比較與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-10水平明顯降低，而IL-17水平明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠B A L F和血清中T h17細胞水平的比較（n g/L）

3 討論

3.1 細胞免疫因子在支氣管哮喘發(fā)病中的作用 免疫細胞因子在機體的免疫過程中扮演著十分重要的角色。本研究結果表明，與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統計學意義。仕麗等[7]探討定喘止哮顆粒對支氣管哮喘模型組大鼠血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影響，結果表明定喘止哮顆粒能夠明顯增加支氣管哮喘模型組大鼠血清中IFN-γ水平，降低IL-4、IL-5水平，主要通過調節(jié)Th1/Th2細胞之間功能平衡，從而達到減輕氣道炎性反應的作用。

3.2 Th17細胞在支氣管哮喘發(fā)病中的作用 隨著環(huán)境問題的日益惡化，我國支氣管哮喘的發(fā)病率已呈逐年上升趨勢，且嚴重影響了患兒的免疫功能，給治療帶來了極大的困難，給家屬帶來了極大的負擔[8-9]。Th17細胞分泌的IL-17是較為強大的促炎細胞因子，其能夠促進多種細胞釋放炎性因子而致使炎癥反應[10]。細胞因子IL-10則具有抗炎作用，能夠有效抑制促炎細胞因子的合成[11]。本研究結果表明，與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-10水平明顯降低，而IL-17水平明顯升高，差異均有統計學意義。魏秀娟等[12]研究發(fā)現，與健康體檢者相比，緩解期支氣管哮喘患者和急性發(fā)作期支氣管哮喘患者血清中IL-17水平明顯升高，同時急性發(fā)作期患者血清中IL-17水平明顯高于緩解期患者，從而表明血清中IL-17水平的高表達可能與支氣管哮喘的形成有關，并對疾病的進程產生一定的影響。張艷麗等[13]采用ELISA法檢測正常健康兒童、哮喘急性發(fā)作患兒、哮喘緩解患兒血清中IL-10水平，結果表明哮喘發(fā)作患兒較哮喘緩解患兒和正常健康兒童血清IL-10水平明顯提高。

綜上所述，支氣管哮喘小鼠肺組織內可見大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且相對陽性著色面積增大，同時BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞分類計數均明顯升高，可能與BALF和血清中IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-17水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低密切相關。本研究還存在不足之處，如研究例數較少等，另外對支氣管哮喘小鼠的免疫機制有待進一步的研究。

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