浸潤性肺腺癌組織上調表達基因的篩選及驗證

劉超武 續力云 陳軍 樂涵波

肺癌是全球癌癥死亡最主要的原因，其5年生存率僅15%，我國肺癌發病率每年增長26.9%，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%，且發病率和病死率仍在迅速上升。肺癌從組織學類型上分為小細胞肺癌（small cell lungcancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC），其中約 80%為 NSCLC，包括腺癌（adenocarcinoma，ADC）、鱗癌（squamous cell carcinoma，SCC）和大細胞癌等，占比最多的是肺腺癌。本研究通過對比浸潤性肺腺癌組織與癌旁組織差異表達基因，篩選及驗證浸潤性肺腺癌組織上調表達基因，尋找肺腺癌診斷和預后評估的新型分子標記物，為進一步探討肺腺癌的發生、發展機制提供實驗依據。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年1月至2015年1月本院經手術病理證實的肺腺癌患者6例，制作癌組織及相應癌旁組織基因表達譜芯片,其中男4例，女2例；年齡52～68，平均62.2歲；腫瘤最大徑1.5～5cm，平均2.6cm；有吸煙史4例；淋巴結轉移1例；所有患者均無胸膜侵犯。另收集2015年1月至2016年6月本院經手術病理證實的肺腺癌組織樣本97例，上述6例樣本亦納入，共103例，應用實時熒光定量PCR技術（qPCR）擴增目的基因，分析癌組織目的基因的表達情況，其中男36例，女 67 例；年齡 53～69（63.0±5.7）歲；腫瘤最大徑 1.5～5（2.54±1.34）cm；有吸煙史 20例；淋巴結轉移 13例；胸膜侵犯19例；根據第7版肺癌TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期1例，Ⅲ期1例。納入標準：所有病例均經術后病理確診；術前未經放化療治療；無明顯肝腎功能損害；術后臨床病理資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫塊大小、病理類型、轉移情況、分期；排除惡性腫瘤史及其他部位原發腫瘤轉移病灶。按2011年肺腺癌新分類標準，經2位病理醫生診斷均為浸潤性肺腺癌。所有標本另取相應癌旁組織（切緣距腫塊2cm）作對照。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 基因芯片制備委托上海伯豪生物技術有限公司完成。運用表達譜芯片平臺制作6例浸潤性肺腺癌組織及相應癌旁組織基因表達譜芯片。芯片的起始樣本為總RNA，采用專用于提取組織總RNA的Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975，Ambion，Austin，TX，美國）提取試劑盒，經NanoDrop ND-2000 分光光度計及 Agilent Bioanalyzer2100（Agilent technologies，Santa Clara，CA，美國）進行質檢。每個樣本使用100ng總RNA，由小牛腸堿性磷酸酶在37℃條件下反應30min進行去磷酸化處理，15%濃度的二甲基亞砜（DMSO）使RNA變性后，通過T4-RNA連接酶（T4 RNA Ligase）連接標記物Cyanine3-pCp，16℃條件下反應2h。標記后對樣本進行干燥處理以去除殘余DMSO。準備好10X阻斷劑。用無核酸酶的純水溶解干燥后的樣品，依次加入阻斷劑和雜交緩沖液，100℃5min后立即轉入冰上放置5min。將雜交樣品緩慢加入墊片的小室中，芯片反應面向下蓋在墊片之上，蓋上并固定，同時避免氣泡產生，20r/min、55℃條件下雜交20h。雜交反應后依次用基因表達清洗緩沖液清洗芯片，在基因表達清洗緩沖液中拆除雜交裝置，并將芯片放入基因表達清洗緩沖液中繼續清洗。盡快掃描芯片，以減少環境氧化劑對信號強度的影響。Feature Extraction（FE）9.5.3軟件提取掃描結果。

1.2.2 引物的設計與合成 所有引物序列均引用于Pubmed、Nucletide Tools，其序列均來自各基因轉錄本的編碼序列（CDS），且所有引物設計條件均滿足以下條件：引物長度17～25bp，GC含量保持在45%～55%，熔鏈溫度（Tm）為 60℃左右，A、C、G、T堿基分布均勻。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本實驗以短小桿菌RNA結合蛋白家族成員-1（PUM1）為內參基因。引物序列如下引物（5′～3′）：PUM1，上游-GGCTTTGGCAGAACGGATTC，下游-TCTCATTCTGCTGGTCTGAAGG；SPINK1，上游-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC，下游-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA；ITGA11，上游-ACCCAATCTGCACACTCCAG，下游-TGGGTTCATTCTTCGGGAGC；TOX3，上游-AGTGGCATAGGAGGGAAAAGC，下游-GACACTTGAGAGGACCGTTTGA；SPP1，上 游 -TGCTTCTTTCTCAGTTTATTGGTTG，下游-AGGGAGTTTCCATGAAGCCAC；MCM10，上游-CACCAGGTTGGTGTCTGAGC，下游-GCTCACCCTCAGCCTTTACA；MMP12，上游-AGTTACCTTCAAAGGCCAAGAGA，下游-AGTCCAAGGATGTTAGGAAGCA；FOXA1，上游-AAGTTACAAGGACCCCAACCC，下游-GAAGCAGAGTTCTTGAGGGCA；TMEM45B，上游-GGCACAGGTGTCCTGATGG，下游-GCGGGTACTTCACTGACCAA；SIX1，上-AAACCAACAGCGATCTCAAGC，下游-AACAGGCGTATCAGTTGCCC；CEACAM1， 上 游 -AGAACCAAAGCGACCCCATC，下游-TCATTGGAGTGGTCCTGCC；CYP2J2，上游-CTGCTCAGATGTGTTGGGACA，下游-ATTCGGACGAGACAGTAGAGC；GDF15， 上 游 -CTGAGACACCCGATTCCTGC， 下 游 -ACACAGTTCCATCAGACCAGC；CLIC6，上游-AGTGCTGGTGGTATCGTGTG，下游-ACTCCCTCCCTAACTGGACC；ESR1，上游-CAGCGACGACAAGTAAAGTGG，下游-TCCCAGATGCTTTGGTGTGG；COLLA1， 上 游 -GCACAGACGGAGATAAATGGC，下游-ATACCAGGCTCAACCACTGC。

1.2.3 實時熒光定量PCR 每一樣本組織均設3個重復孔，反應體系：cDNA 溶液 1μl、SYBRPremix Ex TaqⅡ（2×）10μl、上游引物（10μM）0.8μl、下游引物（10μM）0.8μl、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl、DEPC 水 7μl，共20μl，配制過程均避光在冰上完成。應用7500熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司），擴增反應條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環。每個樣本取3個重復孔Ct值平均數。

1.2.4 觀察指標 以PUM1為內參基因，獲得各樣本組織ΔCt值（各目的基因Ct值-PUM1 Ct值），通過公式RQ=2-ΔCt計算肺腺癌組織RQC值及相應癌旁組織RQN值。然后轉換為對數值log2RQ對肺腺癌組織及相應癌旁組織各目的基因表達水平進行分析。最后通過公式FC值=RQC/RQN得到肺腺癌組織相對于癌旁組織各目的基因FC值，并轉換為對數值log2FC以分析各目的基因在肺腺癌中表達水平。對于FC值≥2，即log2FC≥1，認為該基因在肺腺癌組織表達上調；1/2＜FC值＜2，即-1＜log2FC＜1，認為該基因在肺腺癌組織表達無變化；FC值≤1/2，即log2FC≤-1，認為該基因在肺腺癌組織表達下調。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，肺腺癌組織與相應癌旁組織各目的基因表達水平比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因芯片初步篩選結果 通過Genespring軟件系統，結合SAM軟件分析方法，篩選在兩種軟件較高可信度范圍內均為差異表達基因，結果顯示，與癌旁組織相比，在浸潤性肺腺癌組織，共有1621個上調表達基因（P＜0.05），進一步通過 Gene ontology 、Pathway分析、標記物預測分析和基因網絡關系分析方法對芯片數據進行處理，結合The Lung Cancer數據庫檢索與肺癌發生相關的mRNA信息，初步篩選出在浸潤性肺腺癌組織14個上調表達基因，詳見圖1、表1。

圖1 6例浸潤性肺腺癌癌組織與癌旁組織基因表達主成分分析圖

由圖1可見，主成分1軸（Comp.1）上，癌旁組織樣本基因表達譜分布較集中（綠色點），波動較小，即組內差異較小；主成分2軸（Comp.2）上，各肺腺癌組織樣本基因表達譜所代表的點和各癌旁組織樣本基因表達譜所代表的點分別分布在兩個不同象限，無交叉現象，主成分分析圖表明基因芯片數據較可靠。

2.2 浸潤性肺腺癌組織各目的基因mRNA表達水平分布圖 見圖2。

由圖2可見，以患者編號為橫坐標，以mRNA在浸潤性肺腺癌組織相對癌旁組織表達水平log2FC為縱坐標，按log2FC從小到大排列獲得14個目的基因mRNA在肺腺癌組織表達水平柱形分布圖，結果表明，與相應癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA 在浸潤性肺腺癌組織表達上調，差異均有統計學意義（P＜0.01），而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌組織表達未見上調，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 6例浸潤性肺腺癌癌組織與癌旁組織差異表達基因列表（n=14）

圖2 浸潤性肺腺癌組織各目的基因m R N A表達水平分布圖（橫坐標為患者編號；縱坐標為m R N A在浸潤性肺腺癌組織相對癌旁組織表達水平l o g 2F C）

3 討論

目前，肺癌是人類發病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌是肺癌最常見的病理類型。由于肺癌的高度侵襲性及異質性，多數肺癌患者在確診時已經發生淋巴結、血行或遠處轉移，是其預后較差的主要原因[11]。目前，影像學檢查是術前診斷肺腺癌的主要手段，但其缺乏特異性，且受接診醫生經驗等主觀因素影響較大，仍存在較高的誤診及漏診率。腫瘤分子標記物已逐漸被國內外學者們所發現，對肺腺癌診斷、治療、預后評價等方面具有重要意義[12-14]。本研究從腫瘤分子標記物思路出發，探討在浸潤性肺腺癌組織中上調表達的mRNA分子，可能成為浸潤性肺腺癌早期診斷的新方向。

本研究初期經過基因芯片方法尋找浸潤性肺腺癌組織與癌旁組織差異表達基因，共有14個上調表達基因，分別為 SPINK1、ITGA11、TOX3、SPP1、MCM10、MMP12、COL11A1、SIX1、FOXA1、CLIC6、TMEM45B、GDF15、CEACAM1、ESR1，進一步擴大樣本量檢測浸潤性肺腺癌組織及相應癌旁組織以上14個基因的表達情況，qPCR驗證結果表明，與相應癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸潤性肺腺癌組織上調表達，而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌組織表達未見上調。

SPINK1又稱胰腺分泌的胰蛋白酶抑制劑或腫瘤相關胰蛋白酶抑制劑（tumor-associated trypsin inhibitor，TATI）[15]，在正常情況下表達產生一種胰酶抑制劑，通過自分泌或旁分泌的方式抑制胰蛋白酶分泌，防止自身“過度消化”。現已被證實在多種癌癥，如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肝細胞癌中異常表達[16-18]，且其高表達與腫瘤的浸潤與轉移密切相關，但在肺腺癌中異常表達報道較少。Kati等[19]指出，SPINK1參與了多種生理過程，同時也作為一種急性期反應物，抑制細胞凋亡，在腫瘤的發生、發展中發揮作用，并可能成為腫瘤的治療靶點。Lazar等[20]認為SPINK1可能可以為肺癌的早期診斷提供依據，尤其是鑒別鱗癌與腺癌。Pallante[22]也認為SPINK1通過調節細胞遷移和組織修復，間接地參與肺癌的發生、發展，其過度表達常常提示不良的預后。

TOX3是TOX家族的一員，主要在發育中的小鼠腦中表達，在胚胎E14期達到一個峰值。與乳腺癌的發生有很強的相關性，其表達水平在乳腺癌組織中增加。Mathewos等[23]認為TOX3具有滅活靶向神經元發育的功能，TOX3甲基化在肺癌患者中比較普遍，其在正常肺組織中也可表達，但在肺腫瘤患者的組織中呈現高表達，且在鱗癌患者中表達更高。Jiang等[24]也發現TOX3的存在可能增加肺癌發生的概率，并且在肺癌的發生、發展中扮演重要角色。

MMP-12表達產生的基質金屬蛋白酶是一類具有降解細胞外基質的蛋白酶，通過降解細胞外膠原蛋白及基底膜成分使惡性腫瘤細胞向相鄰周圍組織浸潤、遷移及轉移。Wang等[25]通過研究軟骨肉瘤的侵襲信號通路發現MMP-12與SCLC患者的局部復發和轉移相關。目前，MMP-12 mRNA已被證實在肺癌、肝癌、大腸癌、外陰癌和胰腺癌等諸多癌癥癌組織中有表達[26]。Hofmann等[26]報道MMP-12 mRNA的表達能較好地預測SCLC早期復發和轉移的風險。Lv等[27]通過體外細胞培養研究也證實，MMP-12的高表達與肺腺癌患者的病理分期和腫瘤轉移相關，敲除MMP-12基因可抑制肺腺癌細胞的生長和浸潤，表明MMP-12可能是治療肺腺癌的治療靶點。Tian等[28]應用qRT-PCR的方法檢測NSCLC患者癌組織及癌旁組織差異表達的基因，結果表明MMP-12可能可以參與SCLC的發生、發展，并且可以用作SCLC的潛在標記物或治療靶標。然而，MMP-12 mRNA表達在浸潤性肺腺癌癌組織與癌旁組織是否存在差異鮮有報道。本研究通過熒光定量PCR的方法檢測浸潤性肺腺癌組織及相應癌旁組織MMP-12 mRNA表達，結果顯示MMP-12 mRNA水平在浸潤性肺腺癌組織上調表達，提示可作為肺腺癌診斷和預后評估的新型分子標記物。

細胞內氯離子通道家族（CLIC）在人類中由6個保守蛋白組成，這些保守蛋白是一組神經蛋白，采用可溶性的方式與膜結合[29]。細胞內氯離子通道-6（CLIC-6）是家族中的一員，Achim Bell等[30]發現CLIC-6的下調與腺樣囊性癌的發生、發展有一定的相關性。Yan等[31]研究了CLIC6在人類甲狀腺中的表達，結果表明，CLIC6可能在甲狀腺功能中發揮作用，其可能與家族性甲狀腺腫的遺傳異質性有關。目前很少有文獻報道CLIC6在肺腺癌中的表達和作用，表明CLIC6可能成為診斷肺腺癌的一個新的方向。

TMEM45B，即跨膜蛋白45B，已在多種人類癌癥中觀察到TMEM表達的改變，但是很少有報道TMEM45B在肺癌中的表達和作用。Hu等[32]使用癌癥基因組圖譜重新分析和評估TMEM45B在肺癌組織中的mRNA表達水平。結果顯示，TMEM45B在肺癌中過度表達，且其表達與患者的總生存相關，提示TMEM45B是肺癌中潛在的預后標記物和治療靶標。Zhao等[33]也提出TMEM45B在SCLC的發生、發展中扮演了重要的角色，提示其可能成為肺癌的新型標記物。Molina-Pinelo等[34]進一步研究了肺腺癌患者和肺鱗癌患者組織中TMEM45B的表達差異，結果顯示TMEM45B在肺鱗癌患者癌組織中的表達明顯少于肺腺癌患者，提示TMEM45B可能與不同肺癌病理之間的相關性。

綜上所述，與相應癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸潤性肺腺癌組織上調表達，提示可能對浸潤性肺腺癌診斷及治療具有重要意義，但以上基因在浸潤性肺腺癌發生、發展過程中的作用機制，仍需進一步研究。由于本研究病例數少，仍需更多樣本量對其進行驗證。

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