si-RNA介導FGFR1基因沉默對胃癌細胞生長及凋亡的影響

許超超 金嶸 顏小丹 葉麗萍

據Jemal等[1]報道，2008年世界范圍有近10萬例新發(fā)胃癌患者和73萬余例胃癌患者死亡，超過70%的新發(fā)和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中發(fā)病率最高的是在亞洲東部、東歐和南美。雖然外科手術和術后輔助化療已經改善了胃癌患者的預后，但是胃癌的總體存活率并不令人滿意。因此，了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制和開發(fā)新的靶向治療藥物是必要的。成纖維細胞生長因子受體 1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）是一種高度保守的酪氨酸激酶（RTK）受體，通過與成纖維細胞生長因子（FGFs）結合，可以激活下游的一系列通路，在腫瘤細胞的分化、增殖以及腫瘤血管的生成中起到重要作用[2]。已有研究報道，FGFR1在胃癌組織中呈高表達，且在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[3]。進一步研究表明，在胃腺癌中FGFR1高表達與否與胃癌患者的 10年生存率相關[4]；而且Wen等[5]和 Xu等[6]發(fā)現FGFR1不僅在胃癌組織中是擴增的，在胃癌細胞中也是擴增的，當FGFR1被小分子抑制劑L6123抑制或miR-133b沉默后，可以抑制胃癌細胞的增殖。本研究采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA） 介導FGFR1基因沉默來探討其對胃癌細胞SGC-7901生長及凋亡的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人正常胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學院細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人胃癌細胞SGC-7901購于中南大學湘雅細胞中心；人胃癌細胞株SGC-7901、人正常胃黏膜上皮細胞GES-1均用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；所有細胞株均在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（條件為：37℃、5%CO2、濕度 95%），每隔 1～2d 更換新鮮的培養(yǎng)基，并在細胞長至70%左右，進行傳代、凍存或者下一步實驗。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting法檢測細胞中FGFR1蛋白的表達情況 根據Genbank中提供的FGFR1基因序列，設計相應siRNA的序列，靶向FGFR1的siRNA序列：5′-GGAGGUGCUUCACUUAAGATT-3′，陰性對照（NC）的 siRNA 序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；取對數期生長的胃癌細胞SGC-7901，分3組：NC-siRNA組（轉染NC的siRNA）、siRNA-FGFR1組（轉染靶向FGFR1的siRNA）及空白組（加入相應劑量的滅菌水），先用250μl無血清的培養(yǎng)基分別與Lipofectamine2000（5μl）和 siRNA（5μl）各自混合均勻，再將Lipofectamine2000和siRNA混合均勻，最后將混合后的Lipofectamine2000和siRNA加入6孔板中，采用無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)6h后換成有血清的培養(yǎng)基；2d后收蛋白，采用Western blotting法檢測細胞中FGFR1蛋白的表達情況。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況 取對數生長期的胃癌細胞SGC-7901，分3組，NC-siRNA組、siRNA-FGFR1組及空白組，接種于96孔板（每孔3000～5000個細胞），用配置好的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；在鋪板后的 0、24、48h，觀察每組細胞的生長情況并在每個小孔中加入配置好的 MTT（5mg/ml）25μl，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4h，之后加入150μlDMSO用來溶解結晶，最后酶標儀490nm下讀取OD值，檢測細胞的增殖能力。

1.2.3 克隆集落形成試驗檢測增殖情況 取對數期生長的胃癌細胞SGC-7901，鋪于6孔板中（1000個/孔）并輕輕搖晃，使細胞分散均勻，靜置培養(yǎng)2周；當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時，即可終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS小心浸洗1次，加4%多聚甲醛固定15min，然后去固定液，用PBS再次小心浸洗1次，最后用結晶紫染色20min，用PBS洗去染色液，待干燥后觀察并拍照，觀察細胞集落形成的大小。

1.2.4 流式細胞術分析細胞凋亡情況 取對數期生長的胃癌細胞SGC-7901，鋪于6孔板中培養(yǎng)，貼壁過夜；培養(yǎng)48h后，收取原先的培養(yǎng)基和清洗所用的PBS，然后再收集貼壁的胃癌細胞，4℃、1000r/min，離心4min，棄上清液，并用PBS清洗1次后，繼續(xù)相同條件下離心，保留沉淀，最后加入200μl Binding-buffer重懸沉淀；接著取100μl的細胞重懸液，先用Annexing-V（3μl）染色 10min，接著用 PI（1μl）繼續(xù)染色 5min，最后用Binding-buffer混合均勻后在流式細胞儀上分析細胞凋亡情況。

1.2.5 Hoechst染色法分析細胞凋亡情況 取經70%乙醇浸泡過的蓋玻片，用PBS洗滌以及酒精燈上過火消毒后放置在6孔板中，將對數期生長的胃癌細胞SGC-7901接種于6孔板上（30～40萬個/孔），過夜貼壁，分3組，NC-siRNA組、siRNA-FGFR1組及空白組；培養(yǎng)48h，吸盡培養(yǎng)基后并用固定液固定15min，PBS清洗7min×3次，加入500μl的Hoechst染色液，避光染色10min后繼續(xù)用PBS清洗7min×3次，最后加入適量的抗熒光淬滅劑，并在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)學變化。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FGFR的表達量及siRNA轉染效果 見圖1。

由圖1a可見，與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1（OD值：0.19±0.03）相比，FGFR1蛋白在胃癌細胞 SGC-7901（OD 值：0.77±0.08）中表達增高（t=6.69，P＜0.05）。由圖 1b可見，與空白組（OD 值：0.96±0.08）相比，NC-siRNA組（OD 值：0.88±0.13）對FGFR1蛋白表達的抑制差異無統(tǒng)計學意義（t=0.71，P＞0.05）；而siRNA-FGFR1組（OD值：0.15±0.05）顯著抑制了FGFR1蛋白的表達（t=12.55，P＜0.01）。

圖1 Western blotting法檢測FGFR1蛋白的表達量

2.2 SGC-7901細胞轉染siRNA后對細胞增殖的影響 見圖 2、3。

圖2 SGC-7901細胞轉染si-RNA后細胞的生長曲線

圖3 克隆集落形成試驗檢測S GC-7901細胞轉染si-RNA后細胞集落形成能力

由圖2可見，在轉染后的48h，空白組（OD值：0.62±0.03）和 NC-siRNA 組（OD 值：0.52±0.07）比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.37，P＞0.05），siRNA-FGFR1組（OD值：0.27±0.04）與空白組相比，細胞的生長明顯抑制（t=12.21，P＜0.01）。由圖3可見，siRNA-FGFR1組SGC-7901克隆集落形成在3組中最小，克隆集落形成實驗結果與細胞增殖實驗結果一致。

2.3 SGC-7901細胞轉染siRNA后對細胞凋亡的影響見圖 4、5。

圖4 流式細胞儀檢測SGC-7901細胞轉染s i-R N A后細胞的凋亡情況

由圖 4可見，空白組（1.06±1.35）與 NC-siRNA 組（5.70±1.03）中胃癌SGC-7901細胞早期凋亡百分比差異無統(tǒng)計學意義（t=3.86，P＞0.05），而 siRNA-FGFR1組（27.65±3.49）較空白組細胞早期凋亡百分比顯著升高（t=10.05，P＜0.01）。由圖 5可見，Hoechst染色法的檢測呈現出同樣的結果，siRNA-FGFR1組顯著增加了細胞核裂解和濃縮的比例，細胞核呈亮藍色，可見核呈分葉，碎片狀改變。

3 討論

FGFRs是酪氨酸激酶受體,由胞外配體結合域、跨膜結構域和細胞內酪氨酸激酶結構域3部分組成，目前已經有4種受體蛋白被發(fā)現（FGFR 1～4）。FGFRs的突變激活或過量表達與包括乳腺癌、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、腎細胞癌在內的多種癌癥的發(fā)展及腫瘤周圍血管的生成密切相關。

圖5 Hoechst 33258檢測SGC-7901細胞轉染si-RNA后細胞核形態(tài)的變化

在FGFR1擴增的腫瘤中，小分子ATP競爭性抑制劑或siRNA可通過下調FGFR1的表達來發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。一些學者發(fā)現FGFR1在非小細胞肺癌中是高表達的，當FGFR1被小分子抑制劑（AZD4547、NDGA類似物等）下調后可以有效抑制腫瘤細胞的增殖[7-9]。同樣是肺癌，還有學者發(fā)現在小細胞肺癌中FGFR1也是高表達的，且與肺癌患者的生存率密切相關[10-11]。在乳腺癌中，一些學者發(fā)現FGFR1的高表達與患者的預后、腫瘤大小以及淋巴結轉移等相關，且PD166866（FGFR1小分子抑制劑）可以有效抑制乳腺癌細胞的增殖并促進其凋亡[12-15]。Koole等[16]發(fā)現在頭頸部鱗狀細胞癌中（不管是否存在人類乳頭瘤病毒感染），FGFR1都是高表達的，而且FGFR抑制劑不僅可以抑制癌細胞增殖，還可以與化療藥物聯合而發(fā)揮更明顯的抗腫瘤效果。因此FGFR1在癌癥的治療中可以作為一個有效的靶點。

為了特異性地研究FGFR1對胃癌細胞生物學行為的影響，本研究選擇FGFR1相對表達量較高的胃癌細胞株SGC-7901作為基因沉默研究模型。Western blotting證實siRNA-FGFR1可顯著抑制FGFR1蛋白的表達；并在FGFR1蛋白表達受到穩(wěn)定沉默后，胃癌細胞時間生長曲線結果顯示,在轉染后的48h細胞增殖受到明顯抑制，而且克隆集落實驗也表明siRNA-FGFR1成功抑制了胃癌細胞克隆集落的形成；此外在促進細胞凋亡方面，流式細胞術結果顯示，siRNA-FGFR1可以顯著促進胃癌細胞的早期凋亡，而且通過Hoechst染色法發(fā)現在細胞的形態(tài)學方面，當FGFR1被沉默后胃癌細胞SGC-7901的細胞核裂解和濃縮的比例也較空白組有增加。

本實驗初步證實了以FGFR1為目的基因,通過siRNA技術成功抑制了其在胃癌細胞SGC-7901中的表達，同時發(fā)揮了顯著的抑制胃癌增殖以及誘導胃癌細胞凋亡的抗腫瘤效果，但是其潛在機制有必要進一步研究，而這也正是下一步筆者研究的重點，除此之外，上皮-間質轉化（EMT）是癌癥進展的核心過程，與癌細胞侵犯間質組織并遷移到其他區(qū)域的能力有關，最近已有研究發(fā)現，在頭頸部鱗狀細胞癌中，FGFR1抑制劑可以通過核轉染因子AP-1來影響上皮-間質轉化過程[17-18]；筆者前期研究已經發(fā)現siRNA-FGFR1可以抑制胃癌細胞的侵襲[6]，但是否與EMT以及AP-1有關，則需要進一步研究，以確定并闡明潛在的機制。

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