重癥社區獲得性肺炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4的表達及臨床意義

李俏俏 李隆祥 羅建華 王晨 潘君素

重癥社區獲得性肺炎（SCAP）病死率高，醫療費用高，是臨床醫生經常需要面對的棘手問題.對于SCAP在重視抗菌藥物合理治療的同時更應強調全身綜合治療，包括免疫調節治療。Toll樣受體（TLR）家族作為人體固有免疫系統中的細胞跨膜受體及模式識別受體之一，可以識別多種病原相關分子模式，繼發產生大量炎癥因子，從而在宿主防御中發揮重要作用。TLR家族具有多個成員，至今已發現15種TLRs，研究表明TLR4、TLR5、TLR9在革蘭陰性菌引起的炎癥反應中起重要作用，其中研究最為深入的是TLR4，主要表達于單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞上，是脂多糖（LPS）的天然受體[1]。在動物實驗中，研究的較清楚的是TLR4與LPS介導的信號轉導途徑，其在內毒素耐受產生中亦起關鍵作用[2]。而SCAP患者外周血單核細胞TLR4的表達和炎性因子釋放及體外LPS刺激后TLR4和炎性因子的表達情況及可能的臨床意義，目前報道較少。本研究旨在探討SCAP患者外周血單核細胞TLR4的表達情況及臨床意義，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年1月至2015年1月入住本院呼吸科（15例）及 ICU（35例）的 SCAP患者共 50例（SCAP組），其中男34例，女16例，年齡38～75歲（65±7）歲；根據肺炎嚴重程度評分系統[3]將SCAP組患者按照總分≤50分、51～70分、71～90分、91～130分和＞130分，分為Ⅰ級（1例）、Ⅱ級（4例）、Ⅲ級（23例）、Ⅳ級（17例）和Ⅴ級（5例），并按Ⅰ～Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級分別劃為低、中、高危者。入選標準：均為社區獲得性肺炎患者，未到其他醫院治療；符合美國感染性疾病學會/美國胸科學會2007年頒布的成人社區獲得性肺炎管理指南中危重癥的分型標準。排除標準：院內獲得性重癥肺炎患者，有明確腫瘤病史；長期服用激素、免疫制劑史及免疫缺陷史。選取同期本院健康體檢者50例作為對照組，其中男 32 例，女 18 例，年齡 35～71（62±9）歲。兩組性別、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分析 入院48h內32例SCAP患者獲取合格痰標本，另18例獲取經氣管插管防污染毛刷標本，對這些標本進行病原菌分析。

1.2.2 外周血單核細胞的分離和鑒定 抽取兩組受試者入院第1天空腹外周靜脈血20ml，肝素抗凝并分離血清后，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，將細胞懸液置于細胞培養皿內，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱孵育2h后，獲得貼壁單核細胞，加入1640完全培養液（武漢普諾賽生命科技有限公司，PM150110，500ml），培養12d后備用。在倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯，BX53）下觀察細胞形態，采用流式細胞術對CD14陽性單核細胞進行鑒定。

1.2.3 cDNA模板的合成 本實驗所用的試劑盒、生物酶、基因及引物均由上海生工生物工程技術有限公司提供。采用組織和細胞總RNA提取法（TRIzol法）提取單核細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA模板，反應體系包括：1μg樣本 RNA，水 10μl，RT 緩沖液 5μl，10mM 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1.25μl，40U/L RNA 酶抑制劑0.5μl，經 42℃ 15min，72℃ 5min，4℃ 5min 進行反轉錄，合成的cDNA模板-20℃保存備用。

1.2.4 TLR4 mRNA表達量及炎癥因子水平的測定 采用實時定量PCR法測定TLR4 mRNA的表達量，反應體系包括：cDNA 模板 2μl，水 1μl，1μM 的正向引物1.5μl，1μM 的反向引物 1.5μl，DNA 酶 0.5μl，PCR 反應混合液（PCR Master Mix）5μl，經預變性：95℃，30s；變性：95℃，5s；退火：60℃，30s；延伸：72℃，30s；再延伸：72℃，1min；最后延伸：55℃，30s，循環 40 次，獲得 PCR產物TLR4 mRNA，以內參GAPDH基因為內標，以2-△△Ct法計算TLR4 mRNA的相對表達量。TLR4及內參引物見表1。取分離出的血清，采用ELISA法測定 TNF-α、IL-6、IL-8、C 反應蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）水平，具體操作步驟按試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司提供）說明書進行。在1640完全培養液中，進行重懸單核細胞，加入LPS 40g/ml，培養皿放置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中孵育24h，然后收集單核細胞繼續培養24h后離心，分離血清，實時定量PCR法檢測TLR4 mRNA的表達量，ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT 水平。

表1 T L R 4及內參引物

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCAP組標本分離出的病原體 見表2。

表2 S CA P組標本分離出的病原體[例（%）]

由表2可見，SCAP組病原體主要為革蘭陰性菌，占84.00%，分別是銅綠假單胞菌12例（24.00%）、鮑曼不動桿菌11例（22.00%）、肺炎克雷伯菌9例（18.00%）、大腸桿菌10例（20.00%）。

2.2 兩組在LPS刺激前、后外周血單核細胞TLR4 mRNA表達量及血清炎癥因子水平比較 見表3。

表3 兩組在L P S刺激前、后外周血單核細胞T L R 4m R N A表達量及血清炎癥因子水平比較

由表3可見，LPS刺激前SCAP組外周血單核細胞TLR4 mRNA表達量顯著高于對照組，血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT水平亦高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。LPS刺激后，兩組TLR4 mRNA表達量和血清 TNF-α、IL-6、IL-8、CRP 水平均較刺激前升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），但PCT的表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 SCAP組PSI評分與外周血單核細胞TLR4 mRNA表達量的相關性分析 SCAP組低危28例，TLR4 mRNA表達量8.03±3.17；中危17例，TLR4 mRNA表達量10.49±4.35；高危 5例，TLR4 mRNA 表達量 12.98±2.96。由此可見SCAP組PSI評分越高，TLR4 mRNA表達量也越高，兩者呈正相關性（r=0.641，P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 S CA P組外周血單核細胞T L R 4m R N A表達量與P S I評分的相關性散點圖

3 討論

本研究中SCAP組痰標本中分離出的病原菌主要是革蘭陰性菌，占84.00%，分別是銅綠假單胞菌（24.00%）、鮑曼不動桿菌（22.00%）、肺炎克雷伯菌（18.00%）、大腸桿菌（20.00%）。LPS是革蘭陰性菌細胞壁上主要的致病成分，LPS進入人體后能與單核細胞TLR4相結合，誘導宿主促炎和抗炎因子失衡性表達，進而發生多臟器功能衰竭，這也是重癥肺炎死亡的原因之一[4]。TLR4作為LPS的模式識別受體，起著啟動炎性反應的作用，因此TLR4過量表達與革蘭陰性菌感染所致的SCAP密切相關[5]。

正常情況下，TLR4主要表達于單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞上，以內毒素結合蛋白-CD14-TLR4三聚體的形式識別LPS，并直接啟動炎癥反應的相關信號通路。TLR4的信號轉導通路有髓樣細胞分化因子88（MyD88）依賴和MyD88非依賴兩條途徑。MyD88依賴性信號通路[6]，主要介導核因子-κB（NF-κB）的活化，激活的NF-κB轉入細胞核內，最后導致 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子和調節因子的表達與生成，引發炎癥級聯反應。TLR4亦可激活MyD88非依賴性信號通路[7]，即含TIR結構域誘導干擾素B-接頭蛋白（IFNB-TRIF）依賴性信號通路。TLR4與TRIF相關接頭分子（TRAM）連接，隨即從細胞膜進入胞質與TRIF相互作用，TRIF進而與TRAF3和TRAF6聯合，激活TANK結合激酶1（TBK1）與IKKe，活化干擾素調節因子3（IRF3），誘導干擾素B的轉錄。此外，TRAF6亦可通過受體相互作用蛋白1（RIP1）激活NF-κB和MAPK，誘導促炎性細胞因子合成和釋放。但是過度的炎癥反應可損傷機體正常組織細胞，引起多臟器功能不全。因此，測定TLR4 mRNA的表達量及下游炎癥因子的水平,對SCAP病理機制的研究有著重要的意義。

本研究結果顯示，SCAP組TLR4 mRNA的表達量及血清炎癥因子水平均顯著高于對照組，說明SCAP組患者體內TLR4 mRNA表達量升高，并與病情的嚴重程度呈正相關，這與Zhang等[8]的研究結果一致。高翔等[9]的研究表明，PCT是影響老年重癥肺炎患者預后的重要指標，但在本實驗中，SCAP組加入LPS刺激前后PCT的水平變化差異無統計學意義，可能提示PCT并非是TRL4介導的下游炎癥因子。Dou等[6]認為，NF-κB信號轉導通路是LPS所介導的信號轉導通路中最重要的下游通路。TLR4主要通過活化核因子NF-κB，從而激活呼吸道上皮細胞，增加黏附分子表達，促進上皮細胞中炎性細胞浸潤及產生氧自由基，導致呼吸道的慢性炎癥及組織器官損害，這說明TLR4/NF-κB通路可能是觸發炎癥反應和器官損傷的關鍵靶點。本研究因條件限制，未能對NF-κB表達量進行檢測分析，有待進一步探討。

本研究表明，在LPS刺激后SCAP組和對照組TLR4 mRNA的表達量及血清炎癥因子水平均增高，但SCAP組增幅僅為對照組的2%～18%，提示SCAP患者外周血單核細胞對LPS的反應受損，氣道定植菌長期刺激外周血單核細胞TLR4及NF-κB信號通路處于活化狀態，導致TLR4下調，降低了患者單核細胞對LPS的反應性，最終形成內毒素耐受，這與Mendes等[10]的研究結果一致。內毒素耐受是革蘭陰性菌感染時機體重要的保護機制，能夠明顯減輕“二次打擊”帶來的損傷，對于提高重癥肺炎患者生存率和改善預后具有積極意義。TLR4作為介導LPS信號轉導的主要受體，其表達量和功能下調及TLR4信號通路中各個環節的功能缺陷，都將導致內毒素耐受產生。陳華文等[11]通過動物實驗發現，LPS預處理確實具有誘導“內毒素耐受”的能力,能夠減輕內毒素血癥導致的肺損傷,其機制可能與抑制了炎癥反應和氧自由基生成有關。另有研究表明，TLR4拮抗劑可通過降低LPS對TLR4的刺激，其機制是抑制NF-κB活化，下調促炎細胞因子的釋放，從而減少肺組織損傷[12]。TANG等[13]研究發現，通過分析TLR4的表達量與老年重癥肺炎患者的病死率相關。

綜上所述，TLR4位于炎癥信號轉導的最上游環節，當革蘭陰性菌感染引起SCAP時，TLR4 mRNA表達量顯著增高，在啟動抗感染的固有免疫中起關鍵作用。對TLR4的信號轉導機制的進一步研究，將有助于我們更加明確疾病機制，從而為臨床預防和治療細菌感染提供新的思路和方法，TLR4拮抗劑有望成為SCAP診治中新的分子治療靶點。

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