柔肝寶顆粒質量標準研究

郭小紅，冷 靜，徐 沖，劉 霞，孫 全，冉 強，黃 祎

（重慶市中醫院，重慶 400021）

柔肝寶顆粒由西洋參、酒黃芩、當歸、柴胡、白術、郁金、白芍、桃仁、炒蒺藜、醋鱉甲、黃芪、淫羊藿、丹參、茯苓、防風、土鱉蟲、佛手、知母18味中藥組方，系我院名中醫劉華寶的臨床經驗方，對氣虛血瘀型肝硬化療效顯著[1－2]。其原臨床應用方式為湯劑，為更好地運輸、攜帶、貯存，使質量更穩定[3－4]，現將其開發為顆粒劑。方中西洋參為君藥，主要有效成分為人參皂苷類[5]，以粉末形式加入進行制粒，吸收好，利用度高；黃芩等其他17味中藥水煎煮提取，得稠膏，有效成分黃芩苷水溶性好，能很好轉移至制劑中[6]。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別和高效液相色譜（HPLC）法定量測定，以控制產品質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括G1329B型自動進樣器，Agilent Chemstation化學工作站，G1311C型四元泵，G1315D二極管陣列檢測器）；JA3003J型電子密度天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1．2 試藥

芍藥苷對照品（批號為 110736－200934），人參皂苷 Rg1對照品（批號為110703－201525），人參皂苷 Re對照品（批號為110705－201540），人參皂苷 Rb1對照品（批號為 111509－201522），擬人參皂苷 F11對照品(批號為 1108－201509)，黃芩苷對照品（批號為110715－200212），阿魏酸對照品（批號為 110754－201530，供鑒別用），柴胡對照藥材（批號為 110721－200010），蒺藜對照藥材（批號為 110741 －2009145），佛手對照藥材（批號為110754－201115），均購自中國食品藥品檢定研究院；柔肝寶顆粒（醫院自制制劑，批號分別為 20160310，20160311，20160312，規格為每袋 12 g）；甲醇(批號為 67－56－1)、乙腈(批號為 75－05－8)為色譜純，均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 定性鑒別（TLC法）

西洋參[7]：取 3批樣品，各 3．0 g，分別置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液水浴蒸干，加蒸餾水20 mL溶解，轉移至分液漏斗中進行處理；加入氯仿30 mL，密塞，來回振搖5次，靜置分層，棄下層氯仿液，保留上層水液，同法操作2次；加水飽和正丁醇30 mL，密塞，來回振搖5次，靜置分層，收集上層正丁醇液，下層水液加水飽和正丁醇，同法操作3次，將收集的正丁醇液置分液漏斗中；加氨試液30 mL，密塞，來回提取2次，棄堿液；加20 mL正丁醇飽和水溶液提取，提取2次，棄水液，正丁醇液水浴蒸干，加甲醇，溶解，定容于10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。稱取處方中缺西洋參的其他17味中藥，按柔肝寶顆粒制備工藝制得陰性對照品，取1．0 g，同法制得陰性對照品溶液。另取適量人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re及擬人參皂苷F11，加甲醇溶解，得混合對照品溶液（質量濃度為 1 g／mL）。照 TLC 法（通則 0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）10℃以下放置下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，晾干，105℃加熱，至斑點顯色清晰，置365 nm波長紫外燈下檢視。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照品斑點，位置對應，顏色一致，分離良好，且陰性對照無干擾(見圖1 A)。

柴胡[8]：同 2．1．1項下方法制備供試品溶液。取缺柴胡和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取2．0 g，同法制得陰性對照品溶液。稱取柴胡對照藥材1．0 g，同法制成柴胡對照藥材溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水(8∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，晾干，105℃加熱至斑點顯色清晰。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照藥材的斑點，位置對應，顏色一致，分離度適中，陰性無干擾(見圖1 B)。

酒黃芩[9]：取 3批樣品，各 1．0 g，分別置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯 －甲醇（3∶1）混合溶液 50 mL，超聲提取30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶中，即得供試品溶液。稱取處方中取缺酒黃芩和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取1．0 g，同法制得陰性對照品溶液。取黃芩苷對照品，加甲醇溶解，使得每1 mL溶液中含有1 mg黃芩苷溶液，作為對照品溶液。照TLC法（通則0502)試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －甲醇 －水（13∶7∶2）10℃以下放置下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴1%三氯化鐵溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照品斑點，位置對應，顏色一致，且陰性對照無干擾(見圖1 C)。

白芍[10]：同 2．1．1項下方法制備供試品溶液。稱取處方中缺白芍和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取3．0 g，同法制成陰性對照品溶液。稱芍藥苷對照品，加甲醇溶解，制得1 mL含1 mg芍藥苷的對照品溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －正丁醇 －甲醇 －水（2∶4∶1∶2）10℃以下放置下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴1%香草醛硫酸溶液，晾干，105℃加熱，至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照品斑點，位置對應，顏色一致，且陰性對照無干擾(見圖1 D)。

當歸[11]：取3批樣品，各3．0 g，分別置具塞錐形瓶中，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，超聲處理10 min，離心，取上清液用稀鹽酸調節pH至2～3，用乙醚振搖提取2次（每次20 mL），合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶中，作為供試品溶液。稱取處方中缺當歸和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取3．0 g，同法制成陰性對照品溶液。另取阿魏酸對照品適量，加甲醇溶解，制得每1 mL含有1 mg阿魏酸溶液，作為對照品溶液。照 TLC法（通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯 － 甲醇 － 冰乙酸（10 ∶1 ∶0．5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 mn）下檢視。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照品斑點，位置對應，顏色一致，且陰性對照無干擾(見圖1 E)。

炒蒺藜[12]：同 2．1．1項下方法制備供試品溶液。稱取處方中缺蒺藜和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取3．0 g，同法制得陰性對照品溶液。取蒺藜對照藥材1 g，同法制得蒺藜對照藥材溶液。照 TLC法（通則 0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）10℃以下放置下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良對二甲氨基苯甲醛溶液（對二甲氨基苯甲醛1 g，加鹽酸34 mL、甲醇100 mL，搖勻，即得），105℃加熱至斑點顯色清晰。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照藥材的色譜斑點，分離度良好，位置對應，顏色一致，且陰性對照無干擾(見圖 1 F)。

佛手[13]：取 3批樣品，各 3．0 g，分別置塞錐形瓶中，加50 mL蒸餾水，超聲處理30 min，離心，取上清液，轉移至分液漏斗中，加氯仿提取2次（每次20 mL），合并氯仿液，蒸干，加無水乙醇溶解，定容于5 mL容量瓶，即得供試品溶液。稱取處方中缺佛手和西洋參的其他16味中藥，按制備工藝制得陰性對照品，取2．0 g，同法制得陰性對照品溶液。取佛手對照藥材1 g，同法制得佛手對照藥材溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷 －乙酸乙酯（5∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 mn)下檢視。結果3批供試品溶液色譜基本一致，均能發現對照藥材的色譜斑點，分離度良好，位置對應，顏色一致，且陰性對照無干擾(見圖1 G)。

圖1 薄層色譜圖

2．2 黃芩苷含量測定[7，13]

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（Sysmmetry ShieldTMRP18，250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 0．1% 磷酸溶液（46 ∶54）；檢測波長：280 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：25 ℃ ；進樣量：10 μL。

2．2．2 溶液的制備

取黃芩苷4．44 g，精密稱定，加甲醇超聲溶解定容于25 mL容量瓶，即得質量濃度為0．177 6 g／L的對照品溶液。取樣品0．5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入70%乙醇，超聲處理1．0 h，定容，即得供試品溶液。0．45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2．2．3 方法學考察

專屬性試驗：取缺黃芩的陰性樣品0．5 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液，依法進樣測定。結果陰性對照無干擾(見圖2)。

線性關系考察：取質量濃度為 0．177 6 g／L對照品溶液，精密吸取 1，2，3，4 mL，分別置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋，定容至刻度，得黃芩苷系列質量濃度為 35．52，71．04，106．56，142．08 g ／L 的溶液，吸取上述 4 種溶液及母液(0．177 6 g ／L)，進樣 5 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝3 188．2 X＋12．92，r＝0．999 8（n ＝5）。結果表明，黃芩苷進樣量在 0．123 6 ～0．865 2 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，連續進樣6次，每次 5 μL。結果黃芩苷的峰面積分別為 2 297，2 278．7，2 292．6，2 284．2，2 297．5，2 288．7，RSD 為 1．04%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于 0，3，5，7，9，12 h時分別進樣10 μL，測定。結果黃芩苷峰面積分別為 2 086．8，2 089．1，2 080．5，2 094．4，2 092．5，2 096．4，RSD為0．88%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

圖2 黃芩苷含量測定高效液相色譜圖

重復性試驗：取樣品（批號為20160310）內容物6份，各0．5 g，依法制備供試品溶液，測定峰面積，計算含量。結果黃芩苷含量分別為 6．49，6．63，6．54，6．27，6．47，6．32 mg／g， RSD 為 1．27% （n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（黃芩苷含量為6．48 mg ／g，批號為 20160310）9 份，各 0．25 g，依法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗結果（n＝9）

2．3 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re含量測定[7，14]

2．3．1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（Sysmmetry ShieldTMRP18，250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 －0．1% 磷酸溶液（19 ∶81）；檢測波長：203 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；進樣量：20 μL。

2．3．2 溶液制備

分別稱取人參皂苷 Rg16．43 mg，人參皂苷 Re 9．39 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶，加甲醇溶解，定容，得質量濃度分別為 1．286 g／L和 1．878 g／L的混合對照品溶液。取樣品約12 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶，加入水飽和正丁醇溶液150 mL，超聲溶解1 h，過濾，收集濾液，轉移至分液漏斗中；加入氨試液50 mL提取，提取 5次，棄堿性溶液；加入正丁醇飽和水溶液50 mL提取，提取2次，棄水液，置正丁醇溶液于蒸發皿，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶，即得供試品溶液。0．45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2．3．3 方法學考察

專屬性試驗：取缺西洋參的陰性樣品顆粒12 g，按供試品溶液制備方法，制得陰性供試品溶液，進樣測定。結果陰性對照無干擾(見圖3)。

線性關系考察:取人參皂苷Rg1，Re質量濃度分別為 1．286 g／L 和 1．878 g／L 的混合對照品溶液，精密吸取 2，5，8，10，12 μL，分別進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程人參皂苷 Rg1為 Y＝177．0X ＋38．84，r＝0．999 7（n＝6），表明進樣量線性范圍是 2．572 ～ 15．532 μg；人參皂苷Re為 Y＝195．7 X＋58．76，r＝0．999 6（n＝6），進樣量線性范圍為 3．756 ～ 22．536 μg。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定。結果人參皂苷Rg1的峰面積為2 348．4，2 348．2，2 346．7，2 347．8，2 349．4，2 350．2， RSD 為0．55% （n＝6）；人參皂苷 Re 的峰面積為 3 808．9，3 810．5，3 808．4，3 811．4，3 809．7，3 810．6， RSD 為0．74%（n＝6）。表明儀器精密度良好。

圖3 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re含量測定高效液相色譜圖

穩定性試驗：取同一供試品溶液，室溫下放置，于0，3，5，7，9，12 h 時進樣測定。結果峰面積人參皂苷 Rg1為2 124．7，2 124．5，2 122．8，2 114．9，2 123．7，2 125．3，RSD 為 0．68%（n ＝6）；人參皂苷 Re 為 2 289．1，2 287．5，2 286．9， 2 288．4， 2 289．1，2 289．5，RSD 為 0．79%（n＝6）。表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20160310）6份，各12 g，制備供試品溶液，依法測定。結果人參皂苷Rg1含量分別為 0．242 3，0．238 4，0．242 3，0．248 8，0．245 2，0．238 9 mg／g，RSD 為 1．89% （n＝6）；人參皂苷 Re含量分別為 0．273 6，0．288 7，0．281 2，0．305 6，0．294 5，0．293 7 mg／g，RSD 為 2．49% （n ＝6）。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知人參皂苷Rg1、人參皂苷Re含量的樣品（批號為20160310）9份，各6 g，依法制備供試品溶液，測定峰面積。結果見表2。

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，并進樣測定含量，結果見表3。

3 討論

柔肝寶顆粒含有18味中藥，按照（n／3＋1）原則，選取7味中藥進行TLC鑒別[15]。曾對黃芪進行鑒別，以黃芪甲苷、黃芪對照藥材進行對照，發現陰性對照有干擾，故不將黃芪納入質量標準。故選取西洋參、柴胡、黃芩、白芍、當歸、蒺藜、佛手7味中藥進行TLC鑒別，且選取2種及其以上的展開劑分離效果進行比較，優選最佳分離展開條件。

表2 人參皂苷Rg1和Re加樣回收試驗結果（n＝9）

表3 樣品含量測定結果（mg／g）

處方中君藥為西洋參，系貴重藥材，以超微粉加入制粒，2015年版《中國藥典（一部）》西洋參項下方法以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1為含量測定指標。預試驗發現人參皂苷Rb1色譜峰出峰時間較長（75 min），且分離效果不理想，故不將其納入質量標準。除西洋參外，黃芩、柴胡、黃芪等17味中藥水煎煮提取，其中黃芩為臣藥，2015年版《中國藥典(一部)》中黃芩以黃芩苷為含量測定指標，黃芩苷含量高、水溶性強。故以黃芩苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 3個指標性成分作為定量控制指標。

測定黃芩苷的供試品溶液處理方法較簡單，且提取完全，重復性良好。測定人參皂苷的供試品處理步驟較多，預試驗考察了多種處理方法，以簡化處理流程[16－18]。結果發現，柔肝寶顆粒正丁醇提取同甲醇提取色譜峰分離效果差異不大；提取前是否加氯仿除脂溶性成分，對指標性成分色譜峰影響不大；正丁醇超聲提取和回流提取效果基本一致。

[1]黃 祎，黃 彥，李 梅，等．疏肝健脾解毒方治療肝郁脾虛型HBeAg陽性慢性HBV攜帶者168例的臨床療效[J]．重慶醫學，2014，43(25)：3265 － 3267．

[2]黃 祎，劉華寶，胡文艷．代償期肝硬化逆轉的中醫治療思路探討[J]．中國中醫急癥，2011，20(10)：1634 － 1636．

[3]鄭黎明，林 燕．中藥湯劑與中藥顆粒劑的對比分析[J]．海峽藥學，2015，27(6)：240 －241．

[4]周 華，瞿惠燕，史萬忠．院內中藥制劑推廣使用的現狀和思考[J]．中國醫院藥學雜志，2012，32(11)：886 － 889．

[5]陳 帥，袁崇均，王 笳，等．西洋參超微粉和普通粉的溶出度及藥效學對比研究[J]．四川中醫，2011，29(12)：36 － 39．

[6]辛文妤，宋俊科，何國榮，等．黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J]．中國新藥雜志，2013，22(6)：647 － 653．

[7]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2015：6．

[8]丁 錘，徐 瑩，馬孝熙，等．柴胡屬5種易混藥材的鑒別研究[J]．中藥材，2016，39(9)：1975 － 1981．

[9]高永豐，馬艷玲，趙永亮，等．黃芩薄層色譜鑒別研究[J]．北方藥學，2013，10(2)：6．

[10]田 璐．白芍等十二種常用中藥飲片質量標準研究[D]．北京：北京中醫藥大學，2014．

[11]謝仲德，方應權，李文烈，等．當歸調經膠囊的薄層鑒別與阿魏酸、芍藥苷的測定[J]．中成藥，2013，35(2)：427 － 430．

[12]金曉玲，張 穎，徐麗珊，等．佛手的薄層色譜鑒別[J]．特產研究，2001，23(2)：40 －42．

[13]孫 慧．葛根素、梔子苷、黃芩苷、柚皮苷含量測定的ELISA方法與HPLC方法的相關性研究[D]．北京：北京中醫藥大學，2013．

[14]覃潔萍，姚 蓉，蘇 倩，等．高效液相色譜法同時測定復方扶芳藤合劑中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量[J]．中國醫院藥學雜志，2012，32(5):353 － 355．

[15]盧君蓉，李文兵，傅超美，等．香附藥材的質量控制方法的探討[J]．中國醫院藥學雜志，2015，35(5):389 －392．

[16]陳春鶯，鄒愷平，施 敏．柔肝顆粒的定性定量方法優化研究[J]．中國藥業，2017，26(6)：15 －19．

[17]殷洪梅，徐殿紅，付 娟，等．HPLC－ELSD方法研究不同樣品處理方式對益心舒片中人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量測定的影響[J]．世界科學技術(中醫藥現代化)，2015，17(11):2280－2284．

[18]李冬云，李霞莉．血尿康膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1含量測定[J]．中國藥業，2015，24(12)：66 － 67．