咽炎片超高效液相色譜特征圖譜研究

張春輝 ，焦 琦 ，王國平

(1．中國海洋大學醫藥學院，山東 青島 266003； 2．山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071；3．董家口港出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555； 4．青島大學附屬醫院東區，山東 青島 266061)

咽炎片是由玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油 等12味中藥組方的中藥制劑。其現行質量標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)》。咽炎片有養陰潤肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮咳止癢之功效，用于慢性咽炎引起的咽干、咽癢、刺激性咳嗽等癥。目前，關于咽炎片質量控制研究主要集中在黃芩苷、沒食子酸、丹皮酚、肉桂酸及芍藥苷等的含量測定。為了達到多成分控制咽炎片質量的目的，本試驗中參考了2015年版《中國藥典(一部)》[1]及文獻[2－16]，采用超高效液相色譜（UHPLC）法及雙標峰相對保留時間定位法建立了咽炎片的特征圖譜，以有效控制其內在質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BP211D型電子天平（德國 Sartoris公司，精度為0．01 mg）；AUTO SCIENCE AS10200BT 型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1．2 試藥

（R，S）－告依春對照品（批號為 111753－201505，含量為100%），芍藥苷對照品（批號為 110736－201539，含量為 96．4% ），哈巴俄苷對照品（批號為111730 －201508，含量為 96．0% ），均購自中國食品藥品檢定研究院；咽炎片(國內12家藥品生產企業，批號分 別 為 JLJB151203，YC160603031，YCJBY16030148，XZ160117，XAKL151203，WTGK151001，CCYNK20151006，TG 20150601， HRSJ 1604009 Z， HXYY 35052002，CDDK151207，YCWJS20150506)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Dikma Endeavorsil C18柱（100 mm ×2．1 mm，1．8 μm）；流動相：甲醇（A）－水(B)，梯度洗脫（0～4 min時 90%B→ 80%B，4～10 min時 80%B→40%B，10～14 min時 40%B，14～15 min時 40%B→80%B，15～18 min時 80%B→90%B，18～20 min時 90%B）；柱溫：30 ℃ ；流速：0．2 mL ／min；檢測波長:278 nm；進樣量:1 μL。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于10 000。

2．2 溶液制備

對照品溶液：分別精密稱取（R，S）－告依春、芍藥苷、哈巴俄苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含（R，S）－告依春 41．40 μg、芍藥苷 47．20 μg、哈巴俄苷 38．71 μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取咽炎片樣品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取粉末1 g，精密稱定，精密加入20%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質量，加20%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

各單味藥材溶液及陰性樣品溶液：按咽炎片處方比例及工藝制備玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油單味藥材，及分別缺少玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油的12種陰性樣品，按擬訂方法制備12種單味藥材及12種陰性樣品溶液。

2．3 方法學考察

共有特征峰標定：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、各單味藥材及陰性樣品溶液各1 μL，依法測定，并以“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（國家藥典委員會2012．130723版）進行計算，生成咽炎片的特征圖譜，選定共有特征峰9個。通過對照品溶液、供試品溶液、各單味藥材及陰性樣品溶液的比較，得出供試品溶液圖譜中9個共有特征峰的歸屬。結果見表1和圖1。

表1 咽炎片特征圖譜中共有特征峰在藥材中的歸屬

圖1 超高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一批樣品（批號為WTGK151001），依法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，按擬訂色譜條件進樣6次。結果共有特征峰9個，1～4號以3號峰為參照峰，5～9號以5號峰為參照峰，各特征峰相對保留時間的 RSD均小于1．5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為 WTGK151001）樣品，依法制備6份供試品溶液，分別按擬訂色譜條件進樣測定。結果共有特征峰9個，1～4號以3號峰為參照峰，5～9號以5號峰為參照峰，各特征峰相對保留時間的 RSD均小于1．5%（n＝6），表明該方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為 WTGK151001）樣品，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下于0，1，2，8，12，24 h時進樣，測定。結果共有特征峰 9個，1～4號以3號峰為參照峰，5～9號以5號峰為參照峰，各特征峰相對保留時間的 RSD均小于1．5%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

相對保留時間確定：采用擬訂色譜方法分析6批樣品（批號分別為 JLJB151203，YC160603031，YCJBY16030148，XZ160117，XAKL151203，WTGK151001），各色譜峰相對保留時間見表2。以3號峰為參照峰，1～4號各共有特征峰相對保留時間均值分別為0．73，0．82，1．00，1．22， RSD 均為 0（n＝6）；以 5 號峰為參照峰，5～9號各共有特征峰相對保留時間均值分別為1．00，1．04，1．14，1．23，1．39， RSD 均為 0（n ＝ 6）；允許范圍按±5%計算，各色譜峰相對保留時間均在規定范圍內。

特征圖譜測定結果：對12個樣品進行特征圖譜測定，相對保留時間測定結果見表2。可見，8號和10號樣品未檢出9號峰，其余樣品9個特征峰相對保留時間均未見明顯偏差，符合規定限度。

3 討論

3．1 波長選擇

在特征圖譜建立過程中，對 210，220，245，278 nm 波長進行比較，結果在278 nm波長下色譜峰個數較多，且分離效果較好，可更全面地反映咽炎片的內在質量。因此，最終采用278 nm為特征圖譜檢測波長。

3．2 提取方法選擇

取咽炎片樣品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取粉末1 g，精密稱定，精密加入20%甲醇20 mL，稱定質量，分別超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min和加熱回流30 min，放冷，稱定質量，加20%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按擬訂色譜條件進樣測定，結果差異不大。因此，選用了簡便的超聲處理方法。

3．3 提取溶劑選擇

本試驗中參考文獻[2－13]，比較了以20%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、稀乙醇為提取溶劑超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min的方法，發現采用加20%甲醇超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min的方法提取效果最好，色譜峰數量較多，且峰高優勢較明顯。因此，選用20%甲醇作為提取溶劑。

表2 相對保留時間測定結果

3．4 流動相選擇

咽炎片所含化學成分復雜，極性差異較大，采用等度洗脫難以達到滿意的分離效果，因此考慮梯度洗脫方式。本試驗中曾參考文獻[2－15]，分別考察了甲醇－水、甲醇 －1．5%冰醋酸、甲醇 －0．05%磷酸、乙腈 －0．1%磷酸等不同比例的流動相，并對梯度比例進行了比較，最終確定以甲醇－水為流動相并梯度洗脫的分離效果最好，各特征峰與其他組分峰基本可達基線分離。

3．5 評判方法選擇

查閱文獻[2－13]，未見建立咽炎片特征圖譜的方法報道。傳統的特征峰評判方法是采用單標峰相對保留時間法，因中藥成分復雜，色譜峰重疊較嚴重，采用雙標峰相對保留時間定位法[16]，以減小色譜系統波動對特征峰保留時間的影響，使特征峰的定位更加準確，保證了評價結果的可靠、準確和穩定。

通過采用所建立的特征圖譜色譜評價系統，對12批次的樣品進行測定，結果發現2個批次樣品未檢出9號特征峰，表明2批次樣品可能存在少投料或成分提取不完全的問題，但按照現行質量標準檢驗均為合格樣品，說明所建立的特征圖譜能反映出樣品的真實質量，可作為咽炎片質量控制的有效方法。

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