高效液相色譜法測定婦炎靈洗劑中連翹苷含量*

陳 路 ，翟炎妹 ，閆炳雄 ，吳無畏 ，宋志軍 ，繆劍華 △

（1．廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023； 2．桂林醫學院，廣西 桂林 541004）

現代臨床醫學認為，對于婦科炎癥的治療，應多應用抗生素。但各類抗生素應用存在極大局限性，且耐藥菌株逐年增多，出現不良反應的概率越來越大，已無法滿足人們的需求[1－2]。目前，中藥治療婦科病不僅能取得較好的療效，且無明顯不良反應，安全性極高[3]。通過近10年的應用發展，中成藥洗液已成為醫院重要的婦科炎癥外用制劑[4]。婦炎靈洗劑是20世紀90年代，廣西婦幼保健院在收集壯族民間驗方和整理臨床用藥經驗的基礎上創制出來的中藥外用洗劑，由山銀花、連翹、黃芩、黃柏、白花蛇舌草、大血藤、三棱、莪術、丹參、赤芍等藥材經科學組方，具有清熱解毒、通絡活血之功效，主要用于盆腔炎、附件炎、子宮頸炎，霉菌，滴蟲、真菌性陰道炎、外陰瘙癢，以及男女潰瘍性化膿性生殖器炎癥等。目前，該制劑已在臨床應用23 120多例，對婦科疾病的防治工作起到了巨大作用，但目前該洗劑尚未建立質量控制標準。為此，筆者建立了測定連翹苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Varian 210型高效液相色譜儀（美國瓦里安公司）；CP224S型十萬分之一天平（Sartorius公司）；UV－1240型紫外可見光光度計（Shimadzu公司）。

1．2 試藥

連翹苷對照品（批號為110821－201615，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院)；婦炎靈洗劑(廣西婦幼保健院自制)；甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20160719）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 水（21 ∶79）；檢測波長：277 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取連翹苷94．40 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得對照品貯備液（質量濃度為 0．472 0 g／L）；再精密量取以上對照品貯備液5 mL置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液（質量濃度為 0．236 0 g／L），微孔濾膜濾過，即得。

供試品溶液：精密量取婦炎靈洗液10 mL，水浴蒸干，加50%甲醇溶解，置25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：精密量取不含連翹的陰性樣品10 mL，蒸干，加50%甲醇溶解，置25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2．2項下3種溶液各10 mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示，連翹苷色譜峰分離效果良好，且陰性對照品溶液在相同保留時間處未見干擾，系統適用性良好，專屬性強，詳見圖1。

線性關系考察：分別精密量取連翹苷對照品貯備液（0．472 0 g ／L）1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL，置 10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，依法測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程 Y＝10．088 X －0．909 9，R2＝ 0．999 7(n ＝10)。結果表明，連翹苷進樣量在 0．472 0 ～ 4．720 0 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：吸取同一連翹苷對照品溶液（0．2360g／L），連續重復進樣6次，依法測定，記錄峰面積。結果的RSD為0．75%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品（批號為170201），依法制備供試品溶液，分別于 0，1，2，4，8，12 h 時注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積。結果的 RSD為1．66%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗：精密量取婦炎靈洗劑樣品（批號為170201）10 mL，共 6份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果連翹苷的平均含量為 0．586 8 g／L，RSD為1．44%(n＝6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知連翹苷含量的樣品5 mL（含連翹苷 0．586 8 g／L），分別精密加入上述對照品貯備液3，6，9 mL，低、中、高質量濃度各3份，制備測定，計算回收率。結果見表1。

圖1 婦炎靈洗劑高效液相色譜圖

2．4 樣品含量測定

分別取不同批號的婦炎靈洗劑10批，依法制備供試品溶液，并進樣測定，計算連翹苷含量。結果批號為170201， 170202， 170203， 170204， 170206， 170223，170226，170228，170301，170302 的樣品中連翹苷含量分別為 0．586 8，0．426 9，0．361 0，0．339 0，0．354 2，0．357 7，0．428 3，0．376 6，0．426 9，0．426 9 g ／L。

表1 婦炎靈洗液的加樣回收試驗結果（n＝9）

3 討論

3．1 質量評價指標選擇

[5－8]，對婦炎靈洗劑中6味中藥（山銀花、連翹、黃芩、黃柏、丹參、赤芍）進行分析，以建立最佳質量評價指標。處方中的山銀花、黃芩、黃柏、丹參、赤芍中的主要成分為綠原酸、黃芩苷、小檗堿、丹參酮ⅡA、芍藥苷，在分析時有陰性干擾，且不易排除，故暫不作為本處方的質量評價指標。連翹中連翹苷因無陰性干擾，同時在處方中為君藥，能清熱解毒，既善解在里之熱毒，又能散氣血凝聚、去膿腐，并能疏風止癢[9－10]。現代研究表明，連翹苷具有明顯的抗菌、抗炎和解熱作用，且化學性質穩定[11－13]。因此，以連翹苷作為婦炎靈洗劑的質量評價指標。

3．2 樣品處理方法選擇

樣品的制備方法，摸索了80%醇沉蒸干后甲醇溶解，乙酸乙酯萃蒸干后甲醇溶解[14]，過固相萃取柱蒸干后甲醇溶解，過中性氧化鋁柱蒸干后甲醇溶解，直接甲醇溶解，80%醇沉蒸干后50%甲醇溶解，用固相萃取柱過濾蒸干后50%甲醇溶解，過中性氧化鋁柱蒸干后50%甲醇溶解[15]，蒸干后50%甲醇溶解等處理方法。研究結果表明，以蒸干后50%甲醇制備的樣品，溶解度大，既易行又無陰性干擾。

3．3 流動相選擇

參考文獻[16]，曾選用乙腈－水（25∶78）作流動相，結果連翹苷與樣品中其他峰的分離度小且峰形不好，還采用不同比例的乙腈－水系統，比較樣品的出峰時間、理論板數、分離度和峰形（對稱性），故最終選擇了本方法的流動相比例[乙腈－水（21∶79)]，其保留時間雖長，但分離度高，柱效高，理論板數按連翹苷計算應不低于10 000。采用本方法的流動相測定婦炎靈洗劑中連翹苷的含量，回收率高，線性關系良好，且測定條件易于操作。

3．4 色譜柱選擇

曾采用 Kromasil 100－5 C18柱（150 mm ×4．6 mm，5 μm），Diamomsil C18柱 （250 mm × 4．6 mm，5 μm），Agilent XDB C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）測定樣品溶液。以Kromasil為色譜柱測得樣品溶液的分離度雖較好，但保留時間較長，因而不被采用；而Diamomsil色譜柱測得樣品溶液的峰形差，而不作選擇；Agilent XDB C18色譜柱測得樣品溶液中的連翹苷的保留時間雖長，但與前后雜質峰的分離度均大于1．5，且峰形和分離度均良好，符合《中國藥典》規定。

3．5 檢測波長的選擇

稱取連翹苷對照品 0．22 mg，精密稱定，置 10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，稀釋5倍后，在190～600 nm波長處測定吸光度。結果連翹苷在277 nm波長處有一平滑、明顯的吸收峰，故選擇277 nm為測定波長。

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