小麥花藥液體漂浮離體培養體系的建立與應用

趙林姝，何子偉，劉 麗，古佳玉，謝永盾，郭會君，趙世榮，李軍輝，熊宏春，丁玉萍，劉錄祥

(1.中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物航天誘變技術改良中心/作物分子育種國家工程實驗室，北京 100081；2.西澳基礎工業和農村發展部農業和食品司糧食研發處雙單倍體育種實驗室，澳大利亞珀斯 6151)

花藥培養技術在品種選育、DH遺傳群體構建、突變體創制及轉基因研究中發揮著重要作用[1-7]。自20世紀70年代初首次通過花藥離體培養方法誘導出小麥花粉植株以來[8-9]，各國研究人員通過對小麥花藥離體培養條件和培養方法等深入細致的研究，建立了比較成熟的花藥離體培養體系并廣泛應用[10-13]。

小麥花藥離體培養過程中的脫分化階段有固體培養和液體漂浮培養兩種方式。花藥液體漂浮離體培養技術是在單細胞水平上獲得純系的培養方法，既具有固體培養方法操作簡便的優勢，同時又解決了固體培養方法中存在的細胞壁及其他組織干擾的問題，利用此方法培養的花藥在離體培養過程中會釋放成千上萬個小孢子到液體培養基中，且釋放的花粉小孢子無損傷，因此具有產生更多花粉苗的潛力。研究表明，液體漂浮培養方式具有較好的愈傷誘導及分化效果[14-15]。Broughton[16]建立了一套適于澳大利亞春小麥花藥離體培養的液體誘導培養基(LIM,Liquid induction medium)及花藥培養程序，利用此方法對10個生產上廣泛應用的春小麥品種進行花藥離體培養，結果表明，10個品種中有9個能再生出綠苗，綠苗產率變異范圍為0.00%～56.90%，其中50%品種的綠苗產率高于5%；該實驗室利用此套液體漂浮離體培養體系，結合溫室加代的種植模式，每年可生產2萬余花粉植株。

目前，國內各實驗室小麥花藥離體培養過程中的脫分化階段基本是利用固體培養方式，不同研究團隊采用的培養基不同，主要是C17[17]、W14[18]、癸培養基[19]三種，例如本研究團隊以C17培養基為主[20]，韓曉峰等[21]及王成社等[22]則以W14培養基為主，河南農科院小麥所研制的癸培養基適用于黃淮麥區小麥花藥培養的脫分化培養[19]。為研究小麥花藥液體漂浮離體培養體系的培養效果，本研究團隊抑利用Sue[16,23]建立的液體培養體系，對部分冬小麥品種(系)進行花藥離體培養，并對幼穗低溫預處理的效果進行研究，以探討該花培體系用于我國小麥品種(系)離體培養的可行性，為尋找高效的小麥花藥離體培養體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本研究團隊保存的小麥品種(系)Pavons、Chris、矮抗58、周麥18、H307、H341S、石4185及S6123，于2016年盆栽于中國農業科學院作物科學研究所北圃場溫室，生長期溫度控制在16～30 ℃之間，苗期施緩釋肥一次，全生育期防治蚜蟲及白粉病。

1.2 花藥培養

選取花粉粒發育至單核中晚期(一般在打苞期，穗子尚未露出旗葉葉鞘時)的小麥幼穗，接種前將穗子剝出，用2%次氯酸鈉滅菌30 min，超凈臺中無菌蒸餾水沖洗3～4次備用。液體漂浮離體培養的接種方法及培養基參照Broughton[16]的方法，固體培養為C17培養基[20]。

實驗一：選取小麥品種(系)矮抗58、周麥18、H307、H341S、石4185及S6123的適期幼穗進行接種，研究液體漂浮培養及固體培養方法對小麥的培養效果。每個品種(系)6個穗子，每穗接種花藥60枚。

實驗二：選取小麥品種Pavons及Chris的適期幼穗，留莖稈10～15 cm，將幼穗放入裝有水的燒杯中，錫箔紙包裹放入 4 ℃冰箱分別處理3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d，未進行低溫預處理的幼穗作為對照，研究低溫預處理對小麥花藥液體漂浮離體培養特性的影響。每處理6個穗子，每穗接種花藥60枚。

1.3 花藥培養特性統計與數據分析

愈傷組織誘導率=(產生的愈傷組織塊數/接種花藥數)×100%；

綠苗分化率=(產生的綠苗數/轉分化愈傷數)×100%；

綠苗產率=(產生的綠苗數/接種花藥數)×100%；

白苗分化率=(產生的白苗數/轉分化愈傷數)×100%；

白苗產率=(產生的白苗數/接種花藥數)×100%。

用DPS統計軟件進行各性狀低溫預處理間的多重比較分析(最小顯著差異法，LSD)，SigmaPlot軟件繪制低溫處理花培特性折線圖，Excel進行平均值及標準誤用的計算。

2 結果與分析

2.1 液體漂浮離體培養過程中小麥花藥的脫分化及再分化

單核中晚期花藥(圖1A)接種于液體培養基后藥壁開裂，其中小孢子散落到液體培養基中(圖1B)，利用血球計數板對接種3 d后的液體培養基中的小孢子數進行統計。結果顯示，每毫升培養基中小孢子數可達到50 000左右。接種15 d后培養基中肉眼可見白色顆粒狀物質，30 d可見脫分化形成的帶有胚芽的胚狀體(圖1C)；之后將胚狀體轉入再生培養基中進行分化培養，7 d左右可分化出苗(圖1D)，15 d后即可將分化出的苗進行生根培養。

A: 單核靠邊期小孢子; B: 接種3 d后釋放到液體培養基中的小孢子; C: 培養30 d產生的胚狀體; D: 再生的綠色植株。

A: Microspores at the late uninucleate stage; B: Microspores released from the anther suspension cultured for 3 days; C: Embryos after 30 days of anther culture; D: Regenerated green plantlets.

圖1小麥花藥液體漂浮培養的脫分化及再分化

Fig.1Dedifferentiationandredifferentiationofanthersuspensioncultureinwheat

2.2 兩種離體培養方式下不同小麥品種(系)的花藥培養特性

由表1可以看出，液體漂浮離體培養(LIM)方式下，各被測指標在品種(系)間差異程度不同；固體培養(C17)方式下，被測指標中，愈傷組織誘導率、綠苗分化率及綠苗產率在品種(系)間差異程度不同。液體漂浮離體培養方式下，各品種(系)的愈傷組織誘導率、綠苗分化率、綠苗產率、白苗分化率和白苗產率變異范圍分別為116.48%～633.33%、5.79%～95.42%、10.25%～274.29%、3.27%～80.95%及6.11%～111.03%；固體培養方式下，各品種(系)的愈傷組織誘導率、綠苗分化率、綠苗產率、白苗分化率和白苗產率變異范圍分別為6.64%～31.44%、0.67%～70.02%、0.13%～16.39%、1.67%～14.92%及0.40%～2.11%。各被測指標液體漂浮培養方式品種(系)間的變異范圍均高于固體培養方式。除了H307的白苗分化率表現為固體培養方式高于液體培養方式外，各品種(系)其他被測指標均表現出液體培養方式高于固體培養方式，所研究品種(系)液體漂浮培養方式的愈傷組織誘導率、綠苗分化率、綠苗產率、白苗分化率和白苗產率，分別是固體培養方式相應性狀的3.70～94.95倍、1.24～8.65倍、2.54～149.54倍、2.93～36.11倍和4.77～219.63倍，說明液體培養方式較固體培養方式可獲得更多的愈傷及綠苗，但同時也出現了較多的白苗。

除綠苗分化率在液體漂浮培養及固體培養兩種培養方式下表現的品種(系)排序完全一致外，其他各性狀在兩種培養方式下表現較好的品種(系)并不完全一致。液體培養方式下花藥脫分化形成愈傷能力表現最好的品種(系)是石4185，愈傷分化形成綠苗能力表現較好的品種(系)是H307、S6123和H341S，愈傷分化形成白苗較多的品種(系)是周麥18和石4185。花藥分化形成綠苗能力表現較好的品種(系)是石4185和S6123，花藥分化形成白苗最多的品種(系)是石4185。

2.3 不同低溫預處理的花藥離體培養特性

由圖2、圖3可以看出，低溫預處理對小麥品種Pavons及Chris離體培養性狀的影響各不相同。兩個品種(系)幼穗的愈傷組織誘導率受低溫預處理影響均較小，其中，將幼穗低溫放置3 d和9 d的處理均與對照差異不顯著；小麥品種Chris幼穗在低溫處理6 d后愈傷組織誘導率也與對照沒有顯著差異，但小麥品種Pavons幼穗在低溫處理6 d后愈傷組織誘導率顯著低于對照，兩個品種(系)幼穗低溫預處理12 d、15 d和18 d后的愈傷組織誘導率顯著降低；與綠苗分化相關的兩個指標受低溫處理影響較大，且低溫處理后綠苗分化指標均表現下降的趨勢，除了低溫處理15 d的小麥品種Chris的幼穗綠苗產率與對照無顯著差異外，兩個品種(系)其他各低溫處理的幼穗綠苗分化率和綠苗產率均顯著低于對照；白苗分化率和白苗產率兩個指標，與上述3個指標呈現相反的趨勢，幼穗經低溫預處理后白苗產率呈上升趨勢，兩個品種(系)間具有一定差異。小麥品種Pavons幼穗低溫處理9 d和18 d時產生的白苗顯著多于對照，其他各低溫處理與對照差異不顯著；小麥品種Chris除了低溫處理9 d的幼穗與對照差異不顯著外，其他各低溫處理產生的白苗數均顯著多于對照。

表1 不同小麥品種(系)的花藥培養特性Table 1 Characters of cultured anthers from six different cultivars(lines) of wheat %

LIM：液體漂浮培養；C17：固體培養；同一列數據后的不同字母表示品種(系)間存在顯著差異(采用LSD法，P<0.01)。

LIM:invitrosuspension culture; C17:The solid culture method; Means followed by different letters are significantly different among cultivars according to LSD test(P<0.01).

不同字母表示處理間存在顯著差異(采用LSD 法，P<0.05)。下圖同。

Means followed by different letters are significantly different among pretreatments according to LSD test(P<0.05).The same in figure 3.

圖2低溫預處理對小麥品種Pavons花培特性的影響

Fig.2Effectoflow-temperaturepretreatmentsontheanthercultureabilityofwheatPavons

圖3 低溫預處理對小麥品種Chris花培特性的影響

3 討 論

3.1 花藥液體漂浮培養方法用于小麥離體培養的可行性及應用前景

本研究對6個小麥品種(系)的花藥液體漂浮離體培養特性的研究表明，各性狀在不同品種(系)間均差異程度不同，說明品種(系)間的花藥培養特性是有差異的，此結果與Broughton[16]的研究結果一致。6個品種(系)液體漂浮離體培養方法的出愈及綠苗分化能力均較好，其中，愈傷組織誘導率均高于116.48%，綠苗分化率均高于5.79%，綠苗產率均高于10.25%；說明液體漂浮離體培養方法用于國內小麥品種(系)花藥培養是可行的。對液體漂浮培養及固體培養兩種離體培養方法花培效果的比較研究結果表明，針對綠苗產率這一花藥培養特性重要指標，各品種(系)的液體漂浮培養效果均好于固體培養方法，特別是對固體培養方法很難再生綠苗的品種(系)矮抗58(0.13%)和周麥18(0.33%)，液體漂浮培養方法分別獲得了19.44%和10.25%的綠苗產率，分別是固體培養方法的149.54倍和31.06倍。液體漂浮離體培養這一簡便高效的花藥離體培養技術有望在小麥單倍體育種工作中發揮更大作用。

本試驗中，6個品種(系)均分化出較多的白苗，其中，花藥分化形成綠苗能力較強的品種(系)石4185和S6123，白苗分化率均超過100%，分化綠苗能力最弱的品種(系)周麥18，其白苗產率也超過50%。但同樣綠苗產率較高的品種(系)H307，其白苗分化率只有6.11%。因此，進一步探索影響白苗產生的因素，降低白苗產率，是下一步研究工作的重點。

3.2 低溫預處理對小麥花培特性的影響

由于接種能力的限制，實際工作中常常會出現田間或溫室取回的樣品當天來不及進行接種的問題。小麥小孢子離體培養研究結果表明，幼穗經低溫預處理4～5周可以提高小孢子離體培養過程中的胚狀體及綠苗獲得率[24]。為了探討4 ℃低溫預處理對小麥花藥液體漂浮離體培養效果的影響，本試驗選用6個低溫預處理時間，對兩個小麥品種Pavons及Chris開展了花藥培養特性的研究，結果表明，兩個品種(系)的幼穗對低溫預處理的反應并不完全一致，總體來說，低溫預處理對兩個品種(系)的幼穗均表現出降低愈傷組織誘導率、綠苗獲得率及增加白苗的趨勢，說明低溫預處理對小麥花藥液體漂浮離體培養具有負效應。此結果與小麥小孢子培養[24]及固體培養方法[20-21]需要低溫預處理不同，可能是由于本試驗中對花藥進行了5 d的甘露醇滲透壓預處理。Chris的幼穗在15 d低溫預處理時表現特殊，綠苗產率與對照差異不顯著，此結果是否是品種(系)的效應還有待進一步驗證。除了Chris 15 d低溫預處理外，其他各低溫處理的幼穗雖然綠苗產率顯著低于對照，但均獲得了一定數量的綠苗。因此，實際育種工作中出現無法在取樣當天進行接種的情況時，將幼穗進行4 ℃低溫保存后再進行接種也不失為一種解決辦法。值得說明的是，本研究中低溫預處理實驗所用材料為春小麥品種，低溫預處理對冬小麥品種花藥離體培養特性的影響還有待進一步研究。

致謝：本實驗中花藥液體漂浮離體培養技術得到了西澳基礎工業和農村發展部農業和食品司糧食研發處雙單倍體育種實驗室Sue Broughton的悉心指導，在此深表感謝。

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