重組禽流感病毒H5亞型Re-7株在MDCK細胞上增殖條件的研究

陳宏，王博，趙海源*，李金祥，趙博，李莉,王玉紅，崔凱，朱長動

(1.吉林冠界生物技術有限公司，吉林梅河口 135000；2. 中國農業科學院，北京 100081)

在禽流感病毒中，部分H5和H7亞型毒株可引起高致病性禽流感。我國是世界上禽類養殖量最大的國家，也是高致病性禽流感的爆發區，2015年中國大陸10個省發生16起H5高致病性禽流感疫情，造成的直接經濟損失高達數十億元[1]。這就需要大量安全、高效、低成本的禽流感疫苗。目前市場上大部分疫苗仍為雞胚制備[2]，這種疫苗生產需要消耗大量的SPF雞胚，且勞動強度大、產量不穩定，不利于應對大規模的禽流感疫情爆發。與傳統雞胚生產方法相比，動物細胞培養生產禽流感疫苗具有很多優勢，如抗原匹配性好，可以進行大規模生產和縮短生產周期，自動化控制程度高，批間差異小等。通過我們的研究證明，禽流感病毒在MDCK傳代細胞上具有良好的適應性，用其培養的禽流感病毒獲得的病毒滴度較高。試驗對H5亞型Re-7株病毒在MDCK細胞中的增殖條件進行探索，以期篩選出最適接毒量和最佳收獲時間，為動物細胞生產禽流感疫苗提供了相對穩定的參數指標。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒 MDCK懸浮細胞系是由吉林冠界生物技術公司自行馴化；重組禽流感病毒H5亞型Re-7株購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.2 主要試劑及耗材 選用培養基為國產無血清全懸浮細胞培養基；1%雞紅細胞懸液由吉林冠界生物技術公司自行制備；檢驗用SPF雞胚購自梅里亞公司。

1.3 方法

1.3.1 最適接毒量MOI以及最佳收毒時間的確定

將重組禽流感病毒H5亞型Re-7株種毒以不同的MOI(10-3、10-2、10-1)分別接種于3臺100 L生物反應器(分別命名為1#、2#、3#反應器)相同數量的細胞中，從接毒后的24 h開始，每隔12 h取樣測其毒價(HA滴度、TCID50以及EID50)直至收毒并測其毒價(HA滴度、TCID50以及EID50)。

1.3.2 禽流感病毒在反應器中的接種及增殖過程

接種前將3臺100 L反應器的細胞密度都控制在4×106cells/mL左右，細胞活力控制在95%左右，然后通過無菌的方法將MOI為10-3、10-2、10-1的種毒分別接種至1#、2#、3#反應器的細胞懸液中。從接毒后24 h開始，每隔12 h取樣監測活細胞數以及細胞活率，并使用顯微鏡觀察細胞病變情況。

2 結 果

2.1 最適接毒量MOI以及最佳收獲時間

2.1.1 不同的感染復數(最適接毒量)對病毒增殖的影響 當種毒接入量MOI為10-3時，由于病毒感染量低而使增殖速度降低，無法達到較高的血凝價和毒價。當種毒接入量MOI為10-1時，由于病毒的感染量過高而使感染過快，造成細胞在感染的初期過早的死亡，此時也無法獲得較高的血凝價和毒價。而當種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩定，病毒的血凝價和毒價較高，血凝價最高值為1∶1024[3]，每1 mL病毒含量最高達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達到106.83EID50[4]，結果見表1。

2.2.2 最佳收獲時間的確定 通過對不同感染復數對病毒增殖的研究，確定最適接毒量MOI為10-2，在此接毒量的條件下對最佳收獲時間進行試驗分析，當接毒后60 h血凝價達到1∶1024，每1 mL病毒含量最高達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高達到106.83EID50，并且在接毒后72 h毒價穩定在此水平無明顯變化，說明在接毒后60 h為最佳收獲時間，結果見圖1。

表1 不同的MOI對病毒增殖的影響(HA、TCID50/mL；EID50/0.1mL)Tab 1 Effects of different MOI on viral proliferation(HA、TCID50/mL, EID50/0.1mL)

圖1 最佳收獲時間曲線Fig 1 The best harvest time curve

2.2 禽流感病毒在反應器中的接種及增殖過程

2.2.1 接毒后的活細胞數以及細胞活力 接毒后隨著時間的推移，病毒的感染逐步增強，活細胞數會隨之減少，細胞活率逐漸下降。當種毒接入量MOI為10-3時，由于病毒感染量低細胞活率下降較慢，病毒的增殖會受影響。當種毒接入量MOI為10-1時，由于病毒的感染量過高而使感染過快造成細胞快速死亡，細胞活率下降較快，病毒的增殖也會受到影響。而當種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩定，細胞活率下降的趨勢也較為正常，后期收毒時也能保持較高的毒價[5]，結果見表2。

表2 不同接毒量對接毒后的活細胞數和細胞活力的影響(cells/mL；%)Tab 2 Effects of the number of living cells and cell viability of different venomous antivirus (cells/mL, %)

2.2.2 接毒后病毒的增殖以及在細胞上的病變情況 當種毒接入量MOI為10-2時病毒的增殖比較穩定，細胞活率下降的趨勢也較為正常，通過接毒后取樣鏡檢觀察細胞病變情況可以看出，24 h細胞病變開始出現，有部分細胞表面變得粗糙并伴有裂痕。48 h病變十分明顯，部分細胞破裂，說明此時病毒出芽釋放比較明顯。72 h細胞破碎嚴重，病毒出芽釋放相對完全。結合接毒后48 h～72 h的測毒情況，設定在接毒后60 h的收獲時間是合理的[6]，結果見圖2。

A. 健康細胞(400×)A. healthy cells (400×)

B. 24h細胞病變(400×)B. 24h cell lesion (400×)

C. 48h細胞病變(200×)C. 48h cell lesion (200×)

D. 72h細胞病變(200×)D. 72h cell lesion (200×)

3 討 論

利用動物傳代細胞生產禽流感疫苗與使用雞胚苗相比，在產量及疫苗的穩定性上都有較為明顯的優勢，也在很大程度上降低了由于流感病毒在雞胚上連續傳代而引起HA基因發生突變的幾率[7]，使免疫效果更為可靠。隨著MDCK細胞生產禽流感疫苗推向市場，此疫苗的可靠性也在全國范圍內得到了更多的認可。

本試驗中重組禽流感病毒H5亞型Re-7株接種MDCK細胞，選取了三種不同的接毒量并在接毒后不同時間取樣監測毒價，從而最終確定最適接毒量和最佳收毒時間。在病毒感染復數MOI為10-2時收獲時毒價最高，適當的病毒接種量可以更好的實現病毒的增殖[8]。當接種量過低和細胞數量不匹配，病毒需要經過多次循環復制，達到血凝滴度的峰值的時間延長，病毒生產過程減慢，最終的毒價也不高[9]。當病毒接種量過多時，細胞在病毒的感染下很快死亡，同時會產生大量不具有感染性的不完全病毒顆粒，限制病毒的多循環感染[10]。

收毒時間對于病毒培養過程來說也是一個關鍵性的參數，試驗在確定接毒量的同時對于收毒時間也進行了研究，在接毒后60 h毒價達到峰值，并且在接毒后72 h毒價仍穩定在此峰值水平，沒有明顯的升高或降低，出于對整個工藝流程中時間成本的考慮，收獲的最佳時間應為接毒后60 h左右。

利用生物反應器培養動物細胞進行禽流感疫苗生產的技術已日趨成熟，此種技術在國內外動保行業正在被廣泛推廣[11]。目前我們的生物反應器規模化培養技術水平已經達到能夠放大至6000 L自動控制的規模。試驗對重組禽流感病毒H5亞型Re-7株的最適接毒量和最佳收毒時間進行了研究，確定最適接毒量MOI為10-2、最佳收獲時間為60 h，在100 L生物反應器中重復驗證，獲得穩定的試驗結果，病毒血凝價達到1∶1024，每1 mL病毒含量達到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量達到106.83EID50。研究為禽流感疫苗的生物反應器的規模化生產提供了可靠的理論依據。

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