我國雞源沙門氏菌的血清型分布和對黏菌素耐藥性的研究

張純萍，宋立，崔明全，趙琪，徐士新

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

沙門氏菌是一重要的人畜共患病原菌，不僅能夠引起畜禽的各種疾病，也是最重要的食源性病原菌之一，每年因畜禽產品污染沙門氏菌引起的感染都位居食源性病原菌感染的前列[1]。沙門氏菌血清型眾多，目前已經鑒定出2500多種血清型，不同國家、不同地區雞群中的優勢血清型不同，不同血清型的沙門氏菌對雞和人的致病性也不相同。全球食源性監測網的檢測結果表明，引起公共衛生安全的沙門氏菌以腸炎和鼠傷寒兩種血清型為主[2]。

黏菌素是一種環狀多肽類抗生素，對革蘭氏陰性菌具有強大的抗菌作用，并且具有口服吸收少、殘留低等特點，在獸醫臨床上主要作為飼料添加劑用于食品動物疾病的預防。而在人醫臨床上，隨著多重耐藥革蘭氏陰性菌(又稱“超級細菌”)的不斷出現和蔓延散布，多肽類抗生素已成為治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后一線希望”，而且很可能成為未來幾年治療多重耐藥菌感染的最佳選擇[3]。

由于黏菌素在臨床治療中的重要地位，尤其是在我國研究人員[4]發現mcr-1 (Mobile Colistin Resistance) 基因可通過水平傳播介導細菌對黏菌素產生耐藥性后，對其耐藥性和耐藥機制的研究就已經成為人們關注的焦點。作為一種重要的食源性病原菌，雞源沙門氏菌的血清型分布、對黏菌素的耐藥性以及mcr-1基因的攜帶狀況可為獸醫臨床黏菌素的使用風險評估和公共衛生安全提供一定的參考。鑒于此，我們對從全國不同地區分離的雞源沙門氏菌進行了血清分型和對黏菌素的耐藥性分析，并進行了mcr-1基因的攜帶情況調查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙門氏菌 2014-2016年分離自全國12個省份的成雞盲腸或泄殖腔拭子[5]，總共450株，其中湖南135株，遼寧109株，陜西56株，云南40株，四川33株，山東23株，廣西20株，河北20株，山西6株，廣東5株，湖北2株，江西1株。所有分離菌株均用PCR方法[6]進行了鑒定。

1.1.2 質控菌株和分型血清 大腸桿菌ATCC 25922和ATCC 35218購自中國食品藥品檢定研究院；大腸桿菌SD-9(攜帶mcr-1基因)由中國獸醫藥品監察所安全評價研究室分離并保存；沙門氏菌分型血清購自丹麥血清研究所。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌的血清學分型 根據國標中沙門氏菌的血清學檢驗方法[7]，用丹麥血清分別進行菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的檢測，然后參照沙門氏菌屬抗原表[8]判定血清型。

1.2.2 沙門氏菌對黏菌素的耐藥性測定 根據美國臨床實驗室標準化委員會的標準[9]，用微量肉湯稀釋法測定450株沙門氏菌對黏菌素的MIC值。沙門氏菌對黏菌素的耐藥和敏感折點分別為MIC≥4 μg/mL和MIC≤2 μg/mL[10]，測定濃度范圍為0.12～16 μg/mL，質控菌株為大腸桿菌ATCC 25922和ATCC 35218。

1.2.3 mcr-1基因的克隆測序 為了了解沙門氏菌中mcr-1基因的攜帶情況，本研究對所有菌株進行了mcr-1基因的克隆。擴增片段大小為309 bp，引物序列[6]為： CGGTCAGTCCGTTTGTTC(F)和 CTTGGTCGGTCTGTAGGG(R)。用煮沸法提取細菌DNA后以25 μL反應體系進行PCR反應，反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。取7 μL PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳條件為：電壓110 V，電泳時間30 min。電泳結束后用凝膠成像儀成像分析。陽性條帶進行測序(北京三博遠志生物技術有限公司)驗證。

陰性和陽性質控菌株分別為大腸桿菌ATCC 25922和SD-9。

2 結 果

2.1 沙門氏菌的血清型 本研究共從全國不同地區成雞的盲腸或泄殖腔拭子中分離出450株沙門氏菌，其中73株為II型或不能定型菌株，其余377株為可分型沙門氏菌，分別屬于11種不同的血清型(表1)。由表1可知，腸炎沙門氏菌是最常見的血清型，35.3%的菌株為腸炎沙門氏菌，其次是雞白痢，占比23.8%，鼠傷寒和杜伊斯堡分列第3、4位，上述四種血清型的菌株數量占沙門氏菌分離株的76.2%。

表1 雞源沙門氏菌的血清型分布Tab 1 Serotype distribution of Salmonella from chicken

2.2 沙門氏菌對黏菌素耐藥性 雞源沙門氏菌(包括前4種血清型)對黏菌素的MIC分布和耐藥性結果詳見表2。在450株沙門氏菌中，44.9%的菌株(202株)對黏菌素耐藥(MIC≥4 μg/mL)。由于部分血清型的菌株數量過少(不足20株)，因此未對其進行MIC分布的統計分析，僅分別統計了前4種血清型的MIC分布和耐藥率。

表2 沙門氏菌對黏菌素的MIC分布和耐藥率Tab 2 MIC distribution and resistance rate of Salmonella to colistin

由表2可知，不同血清型的沙門氏菌對黏菌素的耐藥性存在明顯差異。腸炎沙門氏菌對黏菌素的耐藥率最高(62.9%)，其次是雞白痢(50.5%)，這兩種血清型沙門氏菌對黏菌素的MIC50均為4 μg/mL。鼠傷寒沙門氏菌對黏菌素最敏感(僅有7.1%的菌株對黏菌素耐藥)，其MIC50僅為0.5 μg/mL。四種血清型沙門氏菌的MIC90差異明顯，其中雞白痢沙門氏菌的最高，為16 μg/mL，而鼠傷寒沙門氏菌的MIC90僅為1 μg/mL。

2.3 mcr-1基因的攜帶情況 所有沙門氏菌的PCR檢測結果均未出現陽性目的條帶，即所檢測的450株沙門氏菌中均未檢測出mcr-1基因，說明雞源沙門氏菌中mcr-1基因的攜帶并不普遍。

3 討論與小結

3.1 雞源沙門氏菌的血清型分布 研究中雞源沙門氏菌的優勢血清型為腸炎、雞白痢和鼠傷寒，70%以上的菌株屬于這三種血清型。研究資料表明，不同地區、不同樣品來源的沙門氏菌血清型分布存在差異。其中，北京地區健康肉雞沙門氏菌的主要血清型為腸炎和爪哇安那[11]；河北省養殖雞的主要血清型為雞白痢、鼠傷寒和腸炎[12]；而上海活禽和零售禽肉制品中以腸炎、印第安那和鼠傷寒為主[13]；從廣西、江蘇臨床病雞中分離的沙門氏菌則主要是雞白痢[14-15]；在陜西楊凌地區雞肉中分離的沙門氏菌則以鼠傷寒和湯普森為主[16]。綜上所述，由于研究的沙門氏菌來自我國12個省份，因此其血清分型結果基本代表了我國雞源沙門氏菌的血清型分布情況。

與其他國家的研究結果相比，沙門氏菌的血清型分布也具有明顯的地域性特點。在北美地區，美國禽源沙門氏菌的優勢血清型以肯塔基、腸炎和鼠傷寒為主[17]；而加拿大以腸炎、肯塔基和海德堡為主[18]。在歐洲，丹麥分離的禽源沙門氏菌主要為腸炎和鼠傷寒[19]；荷蘭以腸炎、嬰兒、鼠傷寒為主[20]；冰島則以嬰兒和鼠傷寒為主[21]。在非洲，雞源沙門氏菌主要的血清型則為德比和徹斯特[22]。

總體來看，大多數國家和地區沙門氏菌的優勢血清型以腸炎和鼠傷寒為主，與世衛組織公布的兩種最主要的食源性致病血清型[2]一致。但是，在其他血清型的分布上具有明顯差異，因此必須持續監測本地區沙門氏菌的血清型分布情況，以及時了解沙門氏菌的血清型變化，并據此制定合理的防控策略。

3.2 雞源沙門氏菌對黏菌素耐藥性 隨著多粘菌素類藥物在臨床治療中的重要性日益增加，其耐藥性業已成為人們關注的焦點問題。

研究結果表明，沙門氏菌對黏菌素的耐藥性與其血清型密切相關。本研究中一半以上的腸炎和雞白痢沙門氏菌對黏菌素耐藥，而僅有7.1%的鼠傷寒沙門氏菌對黏菌素耐藥，其他研究也得出了同樣的結果[23]。此外，不同地區沙門氏菌的耐藥性不同，在歐洲，42.9% 的雞源沙門氏菌對黏菌素耐藥，其中西班牙分離株的耐藥性高達76.9%[24]；而在本研究中，44.9% 的沙門氏菌分離株對黏菌素耐藥，這種地域性的耐藥性差異與沙門氏菌的血清型分布不同有關。

3.3 雞源沙門氏菌mcr-1基因的攜帶情況 mcr-1是2015年新發現的黏菌素耐藥基因，該基因可經由質粒介導而發生水平傳播，不同于以往普遍認為的染色體突變的耐藥機制，因此引起了全球的廣泛關注。研究對雞源沙門氏菌的mcr-1基因攜帶情況進行了調查，結果表明，所有沙門氏菌分離株，包括耐藥菌株和敏感菌株，均未攜帶mcr-1基因，表明該基因尚未在雞源沙門氏菌中散布，也不是導致沙門氏菌對黏菌素耐藥性的主要機制。

大量研究結果[25]表明，大腸桿菌是mcr-1基因的主要攜帶菌，其他細菌中mcr-1的攜帶率非常低。但是，由于mcr-1可通過接合性質粒轉移到其他細菌，作為重要的食源性病原菌，如果沙門氏菌攜帶了可以水平轉移的耐藥基因元件mcr-1，就會對公共衛生安全帶來極大的威脅；此外，近期研究又發現了mcr-2和mcr-3等新的mcr基因[26-27]，這樣看來，雖然研究中的雞源沙門氏菌未攜帶mcr-1基因，但是并不能排除mcr基因在沙門氏菌發生水平傳播的可能性，因此必須持續監測mcr基因在沙門氏菌中的流行性，以防控mcr基因在沙門氏菌中的散布和傳播。

總之，研究對從我國12個省份分離的450株沙門氏菌進行了血清分型、對黏菌素的耐藥性和mcr-1基因的攜帶情況調查。結果表明，雞源沙門氏菌的優勢血清型以腸炎、雞白痢和鼠傷寒為主；其對黏菌素的耐藥性與血清型分布有關，腸炎沙門氏菌對黏菌素的耐藥性最強，其次為雞白痢，鼠傷寒沙門氏菌對黏菌素最敏感；未檢測出mcr-1基因陽性的沙門氏菌。研究的結果可為我國雞源沙門氏菌感染的防控以及獸醫臨床黏菌素的使用風險評估提供參考。

雖然我國農業部門已經禁止在飼料中添加黏菌素[28]，但是，鑒于人醫臨床多粘菌素用藥的增加以及獸醫飼料中曾經的廣泛長期添加用藥，務必持續監測動物源細菌對黏菌素的耐藥性變化趨勢，以及mcr基因在農業和公共衛生領域的散布情況，以防控黏菌素耐藥菌株的快速散播。

[1] Silva C, Calva E, Maloy S. One Health and food-borne disease:Salmonellatransmission between humans, animals, and plants[J]. Microbiol Spectrum, 2014, 2(1):1-9.

[2] WHO Global Salm-Surv: Progress Report 2000-2005. WHO Press, World Health Organization , 20 avenue appia, 1211 geneva 27[J]. switzerland, 2006 ,24-25.

[3] Biswas S, Brunel J M, Dubus J C,etal. Colistin: an update on the antibiotic of the 21st century [J]. Expert Rev Anti Infect Ther. 2012, 10(8):917-34.

[4] Liu Y Y, Wang Y, Walsh T R,etal. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study [J]. Lancet Infect Dis, 2016, 16(2): 161-168.

[5] 陳惠娟，張純萍，李金貴，等. 不同增菌液和培養基對沙門氏菌分離效果的比較研究[J]. 中國家禽，2011, 33(24): 20-23.

Chen H J, Zhang C P, LI J G,etal. Effect of Different Enrichment Broth and Culture Medium on Isolation Effects ofSalmonella[J]. China Poultry, 2011, 33(24): 20-23.

[6] Rahn K, De Grandis S A, Clarke R C,etal. Amplication of an invA gene sequence osSalmonellatyphimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection os Salmonella [J]. Molecular and Cellular Probes, 1992, 6(4):271-279.

[7] 中華人民共和國衛生部, GB4789.4-2010，食品安全國家標準，食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].

The Ministry of Health of the People's Republic of China, GB4789.4-2010，National Food Safety Standard, Food Microbiological Examination:Salmonella[S].

[8] WHO Collaborating center for reference and research onSalmonella. Antigenic formulae of theSalmonellaserovars [M]. 9th edition, 2007.

[9] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard[S].

[10]Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters (version 7.0). European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing[Z]. valid from 2017-07-01. http: //www.eucast.org/clinical_breakpoints/.

[11]張純萍，寧宜寶，宋立，等. 北京地區健康肉雞攜帶沙門氏菌狀況調查[J].中國獸藥雜志, 2012, 46(10): 9-12.

Zhang C P, Ning Y B, Song L,etal. Investigation on prevalence of carriedSalmonellain healthy broiler in Beijing[J]. Chinese J of Veterinary Drug, 2012, 46(10): 9-12.

[12]劉新靜. 河北省雞沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[D]. 山東農業大學,2015.

Liu X J. Isolation, identification and drug resistance of Salmonella spp. isolated from chicken in Hebei province. Shandong Agricultural University, 2015.

[13]沈海燕，郭慧霞，許學斌，等. 上海市零售禽肉制品和活禽中沙門氏菌血清型與耐藥性研究[J]. 中國畜牧獸醫, 2014, 41(11):263-266.

Shen H Y, Guo H X, Xu X B,etal. Serotype and drug resistance ofSalmonellafrom Retail poultry meat and poultry in Shanghai[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2014, 41(11):263-266.

[14]侯雪嬌，吳科敏，焦鵬濤，等. 廣西地區雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥狀況研究[J]. 廣西畜牧獸醫, 2015, 31(05):227-230.

Hou X J, Wu K M, Jiao P T,etal. Isolation, identification and drug resistance ofSalmonellaenterica isolated from chicken in Guangxi[J]. Guangxi Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 31(05):227-230.

[15]付玉勤. 禽沙門氏菌的分離鑒定、生物被膜測定及耐藥性分析[D]. 揚州大學, 2016.

Fu Y Q. Isolation and identification, biofilm detection and drug resistance analysis ofSalmonellaisolates from poultry[D]. Yangzhou University, 2016.

[16]王嘉煒，肖英平，楊華，等. 雞肉源沙門氏菌血清型、藥敏性及部分耐藥基因研究[J]. 食品科學, 2017, 38(15):140-146.

Wang J W, Xiao Y P, Yang H,etal. Study on serotype, antibiotic susceptibility and some genes associated with quinolones and fluoroquinolines resistance of chicken-borne Salmonella[J]. Food Science, 2017, 38(15):140-146.

[17]The National Antimicrobial Resistance Monitoring System: Enteric Bacteria [R]. NARMS Integrated Report, 2014.

https://www.fda.gov/AnimalVeterinary/SafetyHealth/AntimicrobialResistance/NationalAntimicrobialResistanceMonitoringSystem/ucm059103.htm.

[18]Public Health Agency of Canada. Canadian Antimicrobial Resistance Surveillance System -Report 2008-2009 [R].

http://www.phac-aspc.gc.ca/cipars-picra/pubs-eng.php.

[19]DANMAP 2006 - Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, foods and humans in Denmark[R].

http://www.danmap.org/Downloads/Reports.aspx.

[20]van Duijkeren E , Wannet W J , Houwers D J,etal. Serotype and Phage Type Distribution ofSalmonellaStrains Isolated from Humans, Cattle, Pigs, and Chickens in The Netherlands from 1984 to 2001[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(11): 3980-3985.

[21]Thorsteinsdottir T R, Kristinsson K G, and Gunnarsson E. Antimicrobial resistance and serotype distribution amongSalmonellaspp. in pigs and poultry in Iceland, 2001-2005 [J]. Microb Drug Resis, 2007, 13(4):295-300.

[22]Kagambèga A, Lienemann T, Aulu L,etal. Prevalence and characterization ofSalmonellaenterica from the feces of cattle, poultry, swine and hedgehogs in Burkina Faso and their comparison to humanSalmonellaisolates[J]. BMC Microbiology, 2013, 13(253):1-9.

[23]Jarquin C, Alvarez D, Morales O,etal.Salmonellaon Raw Poultry in Retail Markets in Guatemala: Levels, Antibiotic Susceptibility, and Serovar Distribution[J]. J Food Prot, 2015, 78(9):1642-50.

[24]de Jong A, Bywater R, Butty P,etal. Pan-European monitoring of susceptibility to human-use antimicrobial agents in enteric bacteria isolated from healthy food-producing animals[J]. J. Antimicrob Chemother, 2012; 67(3): 638-651.

[25]易靈嫻，劉藝云，吳仁杰，等. 質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1研究進展[J]. 遺傳, 2017, 39(2): 110―126.

Yi L X, Liu Y Y, WU R J,etal. Research progress on the plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-1[J]. Hereditas, 2017, 39(2): 110-126.

[26]Xavier B B, Lammens C, Ruhal R,etal. Identification of a novel plasmid-mediated colistin-resistance gene, mcr-2, inEscherichiacoli, Belgium, June 2016[J]. Euro Surveill. 2016, 21(27):pii=30280.

http://dx.doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.27.30280

[27]Yin W, Li H, Shen Y,etal. Novel plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-3 inEscherichiacoli[J]. mBio, 2017, 8(3):e00543-17.

https://doi.org/10.1128/mBio.00543-17.

[28]中華人民共和國農業部公告，第2428號[EB/OL].

Announcement No.2428 of the Ministry of Agriculture, the People's Republic of China.http://www.moa.gov.cn/sjzz/syj/yzyj/201608/t20160801_5224428.htm.[EB/OL]