應用高效體積排阻色譜法測定市場抽檢口蹄疫滅活疫苗中的抗原(146S)含量

徐嫄，鄒興啟，劉曉東，李翠，朱元源，李陽，萬建青，何天慈，徐璐，張乾義，王琴，鄭金來，趙啟祖*

(1.中國獸醫藥品監察所, 北京100081; 2.北京市動物疫病預防控制中心, 北京 102629; 3. 北京標馳澤惠生物科技有限公司, 北京 102600)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是傳染性最強的家畜疫病之一，我國目前對口蹄疫采取以滅活疫苗免疫為主的防控策略[1-2]。疫苗對動物的保護效果主要取決于疫苗毒株與流行毒株的匹配度和疫苗中的抗原含量[3]。目前國內口蹄疫滅活疫苗生產企業多以O/MYA98譜系毒株、O/GX/09-7株、OHM/02株、O/HB/HK/99株、AF/72株、AKT-Ⅲ株和Asia1/HN/2006株等毒株生產單價或多價滅活疫苗。《中國獸藥典》[4]規定口蹄疫滅活疫苗效力評估標準是本動物免疫攻毒試驗，必須使用抗體陰性的本動物，存在試驗成本高、生物安全風險、實驗動物福利及環保問題[5]。疫苗中的有效抗原，即完整病毒顆粒(146S)的含量，是口蹄疫滅活疫苗質量的關鍵，是關乎疫苗效力的重要因素。因此，口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測技術的研究成為近幾年關注的重點。目前，大型疫苗生產廠家和國際口蹄疫疫苗儲備庫通用的測定146S含量的方法是利用蔗糖或氯化銫密度梯度分析方法，通過測定各個級份的OD259 nm值，計算出146S濃度，該方法的弊端在于操作較復雜，耗時長，每次檢測樣品數量有限，結果重復性受較多因素影響，因此尚未標準化[6-7]。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)因靈敏度高、特異性強等優點，被廣泛關注，但因其在口蹄疫抗原檢測中的通用性不理想而受到局限[7-9]。高效體積排阻色譜技術(High Performance Size Exclusion Chromatography，HPSEC)，是一種以凝膠色譜柱的分子篩機制，根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術，樣品進入色譜柱后，各組分從大到小一次被洗脫，該技術常用于生物大分子的分離純化[10-11]。Marcelo[12]和楊延麗[13]等，均對該方法應用于測定146S含量檢測進行研究，認為該技術在疫苗生產工藝研究和質量控制中均具有應用前景。Vajda[14]等應用該技術分離三株流感病毒，并通過紅細胞凝聚活性測定進行驗證。王寧[15]等成功利用該法對病毒細胞培養液中的戊型肝炎類病毒顆粒進行實時定量。本試驗應用HPSEC，以外標法對市場抽檢的5批口蹄疫滅活疫苗中的146S含量進行測定，并結合口蹄疫抗原測試卡對抗原類型進行鑒別。

1 材料與方法

1.1 儀器 L-2000型高效液相色譜儀配紫外檢測器(HITACHI)，L203型電子天平(梅特勒-托利多)，himac CF16RX型離心機(HITACHI)，純水機(MiliQ)，生物安全柜(NUAIRE)，PHSJ-4F型pH計(雷磁)，RH basic KT/C型磁力攪拌器，單道移液器(eppendorf)，高壓滅菌鍋。

1.2 試劑與材料 無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正戊醇、氯化鈉(國藥集團 分析純)，50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0含0.15M NaCl)(PBS)，聚乙二醇(PEG)6000(國藥集團 優級純)，206油佐劑，口蹄疫抗原測試卡(北京三聯百晗生物技術有限公司)。

146S(O型)標準品由中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室提供。5批疫苗信息見表1。

表1 口蹄疫滅活疫苗信息Tab 1 Information on FMD inactivated vaccine

1.3 色譜條件 色譜柱：TSKgel G4000SWXL(7.8 mm×30 cm)色譜柱(TOSOH)、TSKgel guardcolumn SWXL(6.0 mm×4 cm)色譜柱保護柱(TOSOH)；流動相：pH7.2的50 mmol/L磷酸緩沖液，含0.1 mol/L Na2SO4；紫外檢測器檢測波長：259 nm；流速：0.6 mL/min；進樣量：100 μL。

1.4 線性回歸方程 用50 mM PBS將濃度為47.4 μg/mL146S標準品進行1.5倍系列稀釋，共配制7個稀釋梯度。HPSEC進樣檢測，以146S濃度為橫坐標，以相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。

1.5 疫苗破乳 使用正戊醇作為破乳試劑，按疫苗體積與破乳試劑體積比9:1充分振搖混合，4 ℃靜置分層后，3000 rpm，4 ℃，離心5 min，小心吸取底層水相用于檢測。

2 結 果

2.1 線性回歸方程 146S標準品溶液線性回歸方程Y=65907X-203584，R2=0.9937，表明146S在4.2～47.4 μg/mL濃度范圍內，與峰面積線性關系良好，見圖1，色譜圖見圖2。

2.2 疫苗146S含量 將疫苗破乳水相檢測結果積分得到的146S峰面積代入標準曲線，即得146S在破乳水相中的濃度。疫苗生產一般以206油佐劑與水相質量1∶1配苗，水相密度約為1.0 kg/L，佐劑密度約為0.85 kg/L，則滅活疫苗中水相體積分率理論值為0.46，故根據破乳后水相146S濃度計算滅活疫苗中146S濃度時，乘以體積系數0.46進行計算，即得滅活疫苗中146S濃度，結果見表2，色譜圖見圖3。

圖1 146S標準曲線Fig 1 Standard curve of 146S

圖2 146S標準品色譜圖Fig 2 Chromatogram of 146S standard

編號破乳水相146S濃度/(μg·mL-1)滅活疫苗146S濃度/(μg·mL-1)14.462.0528.113.7334.412.03410.594.8757.413.41

1號疫苗; 2號疫苗Vaccine 1; Vaccine 2

3號疫苗; 4號疫苗Vaccine 3; Vaccine 4

5號疫苗Vaccine 5圖3 疫苗HPSEC色譜圖Fig 3 Chromatograms of FMD inactivated vaccine

2.3 抗原測試 使用口蹄疫O型、A型和亞洲1型抗原測試卡對5批疫苗抗原進行鑒定，將90 μL破乳水相滴加在樣品孔內，20 min后觀察，結果顯示所有測試卡均出現C線，檢測有效，且T區顯示的結果均與疫苗中抗原血清型相對應。

圖4 抗原測試卡檢測結果Fig 4 Antigen test results of FMD inactivated vaccine

3 討 論

應用HPSEC測定口蹄疫滅活疫苗產品146S含量，有時會遇到分離度不理想或吸收峰不明顯的情況，而在方法學研究中，通過在實驗室PEG沉淀處理濃縮滅活抗原液，配制疫苗，破乳后HPSEC測定水相，可以得到分離度理想的146S的特征吸收峰。分析認為，除了與疫苗中146S的濃度較低有關外，疫苗產品的生產工藝、保存運輸條件對146S有重要的影響。不同工藝生產的疫苗中雜蛋白的含量不同，導致疫苗純度不同，并且146S自身的二十面體結構非常不穩定，在溫度高于56 ℃或pH低于6的條件下很快發生裂解[16-17]，因此，疫苗中可能存在146S的聚集體或降解產物。以上因素給146S含量測定帶來難度。針對目前出現的問題，將結合抗原測試卡、SDS-PAGE、電鏡等技術對影響色譜結果的雜質峰進行深入分析，以優化疫苗的前處理方法。對因146S含量較低檢測色譜峰面積不明顯或色譜峰受雜質干擾嚴重的疫苗，嘗試對破乳水相進行PEG沉淀，濃縮后再次檢測，發現可有效提高146S峰面積，但由于該操作會造成146S的損失，需要計算損失率進行定量。目前，口蹄疫商品苗多為多價疫苗，該方法測定疫苗中146S總量，無法對抗原血清型加以區分，因此本實驗結合口蹄疫抗原測試卡進行鑒定。目前已有口蹄疫O型抗原不同譜系毒株的抗原測試卡，可進一步對疫苗中使用的抗原毒株進行鑒定。應用體積排阻色譜技術測定口蹄疫抗原含量相比蔗糖密度梯度分析等方法更加快捷、高效、準確[13]。隨著檢測方法的優化以及口蹄疫滅活疫苗生產工藝水平的不斷提高，使抗原的純度和穩定性進一步提升，該技術將有望成為口蹄疫滅活疫苗生產過程中質量控制和疫苗終產品質量評價的重要技術方法。

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