雙線紫蛤(Soletellina diphos)形態、序列測定和同工酶的初步研究

(1.莆田市水產技術推廣站，福建 莆田 351100； 2.福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

雙線紫蛤(Soletellinadiphos)隸屬于簾蛤目(Veneroida)、櫻蛤總科(Tellinoidea)、紫云蛤科(Psammobiidae)、紫蛤屬(Soletellina)，其斧足肉質細嫩鮮美，經濟價值高，是一種名貴的底棲雙殼類，也是福建省省級重點保護水生野生動物之一，由于海域環境驟變和人為因素破壞，曾經廣泛分布在莆田市南日島周邊海域的雙線紫蛤自然野生種群資源，目前已銳減。國內外對雙線紫蛤的研究尚不充分，文獻檢索集中在人工繁育[1-2]、性狀差異[3]、血細胞分類[4]、毒素[5-8]及重金屬[9]毒理、生化成分[10]和機體代謝[11-12]等領域，極少涉及分子遺傳[13]方向。紫蛤屬的種間形態較為相似，部分學名、俗名和同種異名的處理使用及其對應的翻譯仍未很好的統一，例如雙線紫蛤(中國)的命名，也有學者報道采用雙線血蛤、雙線血蚶、雙線紫云蛤、西施舌(臺灣地區)、雙線西施舌、西刀舌、西肚舌、紫晃肉、紫蛤、紫貝、富士紫貝、Hiatuladiphos(中國、菲律賓、荷蘭)、Psammotaeadiphos、Sanguinolariaacuminata(日本)、Sanguinolariadiphos(中國)、Solendiphos、Solenviolaceus、Soletellinaacuminata、Soletellinaadamsii(日本)、Soletellinacumingiana、Soletellinadiphos(中國、印度)、Soletellinaradiata等，同種的眾多異名可能存在“異種”，僅憑記錄提及，缺乏確實存在的標本證據、細節圖片或分子生態數據，難以進一步采樣比對區分，致使對現有的野生種質資源鑒定、多樣性分析等研究進度遲緩。

南日島位于莆田市興化灣口外，地處東經119°26′～119°34′、北緯25°09′～25°15′，是福建省第三大海島，灘涂和海域廣闊，海洋生物資源豐富，為農業部審查通過的珍稀瀕危水生動物——雙線紫蛤增殖放流苗種供應單位基地，為順利開展本地區雙線紫蛤的原種保護、自然資源恢復、規?；斯し庇?、遺傳改良和可持續開發利用提供了有力保障。

為調研南日島雙線紫蛤自然種群的種質情況，本研究通過測錄養殖和野生群體不同生長時期4個貝殼形態性狀，克隆野生個體8條序列并與紫云蛤科或櫻蛤總科內部分相關序列比較同源性和進化關系，進行野生群體不同組織6種同工酶電泳，以分析表達活性及組織特異性，以期為今后南日島雙線紫蛤資源的遺傳結構和多樣性分析、保護區規劃、企業和地方標準制定等提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用雙線紫蛤樣本由福建省南日島海洋生物技術有限公司于2011年4月至2016年9月分批贊助提供，野生樣本隨機采捕于海區潮間帶，養殖樣本采集自該企業育苗養殖池。

1.2 方法

1.2.1 形態測定

雙線紫蛤樣本洗凈黏附物后，輪番輕甩數下，置于白瓷盤內用濾紙盡量拭干殼表與外露鮮體部的殘留水漬，使用游標卡尺和電子天平測定殼長(L)、殼高(H)、殼寬(B)和個體鮮重(W)等性狀指標。用Excel軟件處理所測量樣本各形態參數，計算其平均值、標準偏差并導出參數間的關系式。

1.2.2 序列擴增

雙線紫蛤樣本解剖取閉殼肌，DNA提取采用TIANGEN海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ABI Veriti PCR儀擴增12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS和28S rRNA序列，產物回收送樣[14]。測序結果提交GenBank，核酸序列同源性采用NCBI blastn在線程序比對，Clustal X package對位，MEGA 4.0鄰接法構建系統進化樹，Kimura 2-parameter計算遺傳距離(bootstrap值重復1 000次)。

表1 用于南日島雙線紫蛤序列的部分有效擴增引物

續表1

1.2.3 同工酶電泳

解剖雙線紫蛤樣本，分別稱取0.5 g閉殼肌、0.5 g斧足肌，各加入3倍體積4℃預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)冰浴勻漿，4℃抽提1.0 h，4℃離心(14 000 r/min，15 min)至上清液澄清，應用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳對同工酶酯酶(EST)、蘋果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)進行分析，分離膠(pH 8.8，8.2%)和濃縮膠(pH 6.8，3.6%)制膠凝固2 h，1×Tris-Gly電泳緩沖液，上清液10 μL與等體積甘油加樣緩沖液混勻上樣，4℃電泳(90 V，40 mA，4～8 h)[14]，電泳結束浸入染液[15]染色，沖洗、脫色后拍照。

2 結果

2.1 形態測定

南日島雙線紫蛤群體測量的樣本總數為67枚，含養殖1齡貝20枚、野生2～3齡貝47枚，另觀察人工育苗的2～3月齡幼貝若干(圖1)。經測量計算，所采樣本1齡貝的殼長為3.90～5.50 cm，平均(4.61±0.45)cm；殼高為1.80～2.70 cm，平均(2.24±0.23)cm；體重為3.50～10.50 g，平均(6.32±1.79)g；殼長為殼高的1.91～2.19倍，平均(2.06±0.08)倍；殼長為體重的0.52～1.14倍，平均(0.77±0.16)倍；殼高為體重的0.26～0.54倍，平均(0.37±0.07)倍。2～3齡貝的殼長為8.16～11.59 cm，平均(9.51±0.73)cm；殼高為3.96～5.60 cm，平均(4.60±0.36)cm；殼寬為2.01～2.36 cm，平均(2.22±0.10)cm；體重為35.70～112.20 g，平均(57.88±15.87)g；殼長為殼高的1.88～2.21倍，平均(2.07±0.08)倍；殼長為殼寬的3.85～4.68倍，平均(4.20±0.19)倍；殼高為殼寬的1.79～2.20倍，平均(2.03±0.09)倍；殼長為體重的0.10～0.24倍，平均(0.17±0.03)倍；殼高為體重的0.05～0.11倍，平均(0.08±0.01)倍；殼寬為體重的0.03～0.05倍，平均(0.04±0.00)倍。樣本殼長、殼高關系式為線性H=0.478 7L+0.042 5(R2=0.983 1)，殼長、體重關系式為乘冪W=0.059 1L3.045 9(R2=0.990 2)，殼高、體重關系式為乘冪W=0.529 5H3.058 2(R2=0.993 2)，關系式R2值越高表示樣本個體間蛤殼形態的兩兩性狀之間的相關性越高。

注：A：2～3月齡貝；B：1齡貝；C：2～3齡貝。

Notes：A was 2～3 months old shellfish，B was 1 year old shellfish，C was 2～3 years old shellfish.

2.2 序列擴增

南日島雙線紫蛤野生個體的12S rRNA(KU521370)分子量436 bp，與數據庫中同源序列JN398363(439 bp)相似性為91.8%，種內距離為0.076 0，其中保守位點404個，變異位點31個、占7.0%，沒有簡約信息位點、自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為31.3%、28.7%、16.8%、23.2%、60.0%，A+T含量高于G+C，沒有插入位點，缺失位點5個，轉換突變的核苷酸位點19個，顛換突變的核苷酸位點12個，轉換顛換比為1.58。櫻蛤總科(Tellinoidea)12S rRNA系統發育樹中雙線紫蛤KU521370(福建莆田)與JN398363(廣西北海)聚支、節點支持率為100%，二者與同屬紫云蛤科(Psammobiidae)血蛤屬(Nuttallia)的紫彩血蛤(N.olivacea)種間距離為0.300 7；同櫻蛤科(Tellinidae)白櫻蛤屬(Limecola)的波羅的海白櫻蛤(L.balthica)、明櫻蛤屬(Moerella)的彩虹明櫻蛤(M.iridescens)遺傳距離分別為0.172 9、0.185 4，與雙帶蛤科(Semelidae)雙帶蛤屬(Semele)的粗雙帶蛤(S.scabra)種間距離為0.335 8，與截蟶科(Solecurtidae)截蟶屬(Solecurtus)的總角截蟶(S.divaricatus)、縊蟶屬(Sinonovacula)的縊蟶(S.constricta)種間距離分別為0.195 5、0.357 8(圖2)。

16S rRNA(KM411962)分子量516 bp，與同源序列JN398363(474 bp)相似性為88.7%，種內距離為0.121 9，保守位點423個，變異位點49個、10.3%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.7%、31.1%、14.5%、27.7%、57.8%，A+T含量稍高于G+C，沒有插入位點，缺失位點5個，轉換突變位點30個，顛換突變位點19個，轉換顛換比為1.58；與疑似同種異名的亞當斯紫蛤(S.adamsii)(日本宮崎市)序列AB751315(475 bp)相似性為99.8%，遺傳距離為0.002 2，保守位點474個，變異位點1個、占0.2%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.9%、30.2%、15.1%、27.8%、57.1%，A+T含量高于G+C，沒有插入及缺失位點，轉換突變位點1個。紫云蛤科16S rRNA系統發育樹中雙線紫蛤KM411962與JN398363沒有優先聚支，而是與亞當斯紫蛤聚集、節點支持率達100%，后與中國紫蛤(S.chinensis)群體、JN398363、綠紫蛤(S.virescens)群體聯合成一個紫蛤屬簇群，紫蛤屬的姊妹簇群由本屬的尖紫蛤(S.acuta)、紫云蛤屬(Psammotaea)的小紫蛤(P.minor)和長型紫云蛤(P.elongata)群體組成；其并簇為蒴蛤屬(Asaphis)的紅樹蒴蛤(A.deflorata)、對生蒴蛤(A.violascens)和地蛤屬(Gari)的斑紋地蛤(G.maculosa)、射線斜紋紫云蛤(G.pallida)、G.pusilla，外支為紫蛤屬的S.petalina、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤(S.tchangsii)；血蛤屬的日本血蛤(N.japonica)、紫彩血蛤群體形成了紫云蛤科16S rRNA系統樹的外群。南日島雙線紫蛤樣本與亞當斯紫蛤遺傳距離最近，小于雙線紫蛤不同地理個體間的距離0.121 9；與中國紫蛤群體的平均距離為0.090 2、小于種內距離，同綠紫蛤群體距離為0.163 7、稍大于種內距離，與尖紫蛤距離為0.190 0，與S.petalina距離為0.232 7、為屬內最大；而雙線紫蛤JN398363與中國紫蛤距離最近，為0.103 9，其次為亞當斯紫蛤的0.119 2、綠紫蛤的0.143 9(圖3)。

COI(KU605621)分子量1 760 bp，KU605621與2條種內同源序列JN859948(654 bp)、JN398363(654 bp)相似性分別為100.0%、83.2%，種內距離分別為0.000 0、0.193 0，其中保守位點654個、544個，變異位點0個、110個，各分別占比0.0%、16.8%，沒有簡約信息位點，自裔位點110個，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為19.0%、41.8%、15.6%、23.6%、60.8%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，Pos #1堿基G的含量最高(32.1%)，堿基T的含量依次為Pos #3(52.3%)>Pos #2(45.0%)>Pos #1(28.1%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為19.3%、52.3%、5.2%、23.2%，沒有插入和缺失位點，轉換位點67個，顛換位點43個，轉換顛換比1.56。紫云蛤科COI系統樹主要為兩個大分支，雙線紫蛤KU605621與同種的JN859948聚集、支持率為100%，卻與JN398363沒有聚支，分支也不同。系統樹一大分支為紫蛤屬，由中國紫蛤、雙線紫蛤KU605621和JN859948、綠紫蛤群體組成，其中雙線紫蛤KU605621和JN859948與中國紫蛤、綠紫蛤種間遺傳距離分別為0.168 4、0.186 2，小于與JN398363的種內距離0.193 0；另一大分支則由紫云蛤屬的長型紫云蛤、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤群體和蒴蛤屬的紅樹蒴蛤、紫蛤屬的雙線紫蛤JN398363構成，雙線紫蛤JN398363與紅樹蒴蛤遺傳距離最小、為0.165 8，其次是中國紫蛤的0.175 0、長型紫云蛤的0.191 2，與綠紫蛤和張氏紫蛤平均距離分別為0.196 7和0.231 2；兩大分支的外支為地蛤屬的斑紋地蛤，血蛤屬的紫彩血蛤群體形成系統樹的外群(圖4)。

Cytb(KU568465)分子量1 216 bp，KU568465與同源序列JN398363(1 076 bp)相似性為84.4%，種內距離為0.177 1，保守位點908個，變異位點168個、占15.6%，沒有簡約信息位點及自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為23.0%、40.3%、15.4%、21.3%、63.3%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，堿基T的含量均為最高，依次Pos #3(49.7%)>Pos #2(40.6%)>Pos #1(30.6%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為21.8%、49.7%、9.5%、19.0%，沒有插入和缺失位點，轉換突變位點100個，顛換突變位點68個，轉換顛換比1.47。櫻蛤總科Cytb系統樹中雙線紫蛤KU568465與JN398363聚集、支持率為99%，再與截蟶科的總角截蟶相聚、支持率為95%，種間距離為0.219 3，后與波羅的海白櫻蛤群體和彩虹明櫻蛤組成的小支集合，外支為粗雙帶蛤和紫彩血蛤，縊蟶為外群(圖5)。

H3(KU605616-20)分子量374 bp，KU605616-20數據庫暫未檢索到種內同源序列。櫻蛤總科H3系統樹中雙線紫蛤KU605616-20聚集、支持率為86%，與同科的紅樹蒴蛤、斑紋地蛤形成系統樹的外群，種間距離分別為0.061 4、0.055 7；斧蛤科(Donacidae)斧蛤屬(Donax)的截形斧蛤(D.trunculus)、長條斧蛤(D.variegatus)、D.veruinus、三角斧蛤(D.deltoides)組成系統樹的一個獨立小支，系統樹的大支為混合簇，由雙帶蛤科團結蛤屬(Abra)的A.prismatica、白色唱片蛤(A.alba)和光澤唱片蛤(A.nitida)、長舌蛤科(Scrobiculariidae)長舌蛤屬(Scrobicularia)的淺溝長舌蛤(S.plana)、截蟶科Tagelus屬的美國截蟶(T.plebeius)、櫻蛤科Ameritella屬的多彩櫻蛤(A.versicolor)、Scissula屬的素櫻蛤(S.similis)、白櫻蛤屬的波羅的海白櫻蛤聚成(圖6)。

18S rRNA(KX185515)分子量1 788 bp，KX185515暫未有種內同源序列。紫云蛤科18S rRNA系統樹中雙線紫蛤KX185515與地蛤屬的中型地蛤(G.intermedia)、斑紋地蛤及紫云蛤屬的長型紫云蛤聚簇、支持率為100%，與三者種間距離均為0.001 8，外群為蒴蛤屬的對生蒴蛤、紅樹蒴蛤(圖7)。

18S-28S rRNA(KX495219-20)分子量2 534 bp，含約800 bp的18S rRNA、800 bp的28S rRNA及近900 bp的ITS區序列，KX495219-20暫無種內同源序列。櫻蛤總科ITS區系統樹中雙線紫蛤KX495219-20先與同科血蛤屬的模糊紫云蛤(N.obscurata)聚簇、支持率為98%，平均種間距離為0.266 2，后與櫻蛤科的波羅的海白櫻蛤、櫻蛤(Macomanasuta)相聚，外群為截蟶科的縊蟶(圖8)。

28S rRNA(KU555423)分子量1 539 bp，KU555423暫未有種內同源序列，與亞當斯紫蛤序列AB746862(1 407 bp)相似性為100.0%，遺傳距離為0.000 0，保守位點1 407個，變異位點0個、占0.0%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為20.5%、18.3%、26.9%、34.3%、38.8%，A+T含量明顯低于G+C，沒有插入、缺失位點。紫云蛤科28S rRNA系統樹為兩個分支，較大分支中雙線紫蛤KU555423與亞當斯紫蛤、同屬的綠紫蛤先后聚支，支持率均為100%，雙線紫蛤同綠紫蛤種間距離為0.006 6，尖紫蛤與紫云蛤屬的長型紫云蛤和小紫蛤混支，大分支的外側為S.petalina；稍小分支由蒴蛤屬的對生蒴蛤、紅樹蒴蛤和地蛤屬的射線斜紋紫云蛤、中型地蛤、G.pusilla獨立小支匯成，系統樹外群為血蛤屬的日本血蛤(圖9)。

2.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤野生群體示例樣本的總數為15枚，染色圖譜顯示閉殼肌和斧足肌中大部分同工酶的表達調控具有組織特異性，群內個體同組織同種酶的條帶表型、共有酶帶活性和遷移較一致。EST為正染色、酶譜較復雜，閉殼肌的酶帶數有7～8條，斧足肌有4～5條或更多，組織特異性明顯，酶位點活性表達強弱不同，樣本個體間可見明顯多態性；IDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有3條，組織特異性明顯，酶帶活性表達強弱不同，個體間未見多態性；LDH為正染色，閉殼肌的酶帶有1或3條，斧足肌沒有酶帶，組織特異性明顯，酶位點活性表達強弱稍有不同，個體間沒有多態性；MDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有1條，組織特異性明顯，酶位點活性表達強弱較一致，個體間未見多態性；ME為正染色，閉殼肌的酶帶有3或4條，斧足肌有2條，組織特異性明顯，酶位點活性表達強弱有些許不同，個體間沒有多態性；SOD為負染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有2條，組織特異性不明顯，酶位點活性表達強弱不同，個體間未見明顯多態性(圖10)。

注：A：酯酶(EST)；B：異檸檬酸脫氫酶(IDH)；C：乳酸脫氫酶(LDH)；D：蘋果酸脫氫酶(MDH)；E：蘋果酸酶(ME)；F：超氧化物歧化酶(SOD)；1：閉殼肌；2：斧足肌。

Notes：A：EST；B：IDH；C：LDH；D：MDH；E：ME；F：SOD；1：Adductor muscle；2：Axe-shaped foot muscle.

3 討論

3.1 形態測定

南日島雙線紫蛤樣本的兩殼相等、呈長橢圓形，殼質薄、解剖時邊緣受外力作用時易碎，灰紫色蛤殼表被有棕黃褐色的殼皮、同心圓狀生長線細密，部分2～3齡貝的殼皮延伸出蛤殼腹緣些許，喜深潛鉆穴并埋棲于潮間帶細沙內生活，殼皮常有破損，自殼頂射出2條放射狀淺色的色帶至殼后腹緣，因殼皮伴隨著生長逐漸加厚、色澤逐漸加深，使幼貝的放射條紋較成貝更易于觀察(圖1)。測定結果顯示，隨著雙線紫蛤貝齡的增加，殼長、殼高、殼寬和體重參數變大，1齡貝的殼長體重比(0.77±0.16)、殼高體重比(0.37±0.07)分別降低至2～3齡貝的(0.17±0.03)、(0.08±0.01)，殼長殼高比相對較穩定，生長過程中未發生明顯改變，個體的體重與殼高呈現出最高的相關性，其次是與殼長，而殼高和殼長也有著一定的關聯。合浦珠母貝(Pinctadafucata)[16]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[17]等的測定計算結果也表明，殼長、殼高、殼寬3個形態性狀與體重這一質量性狀的相關性極顯著，輻射莢蟶(Siliquaradiata)[18]殼長與殼高的直線回歸關系亦較密切。同齡貝中，樣本個體間體重數據及標準偏差波動范圍較大，推測其原因除個體自身營養、生理條件差異外，也可能是因為采捕時樣本受驚雙殼突然緊閉，體內封入了一部分海水，即使多輪甩干、濾紙吸水以求降低海水含量，但后續解剖發現余存海水仍未完全消除而致。樣本的同貝齡個體間無明顯形態特征差異，可能是南日島雙線紫蛤種群的分布規模仍不夠理想、遺傳背景缺乏外來基因流入、交換相對穩定以及所處生長環境較一致共同作用的結果。生物餌料投喂量和組成類型[1]、海區底質[2]等多方面影響雙線紫蛤存活、生長與繁育，多元分析韌帶長、前后緣長等性狀指標說明北部灣海區的雙線紫蛤4個地理群體間形態參數有不同程度的判別差異[3]，表明雙線紫蛤生長的環境因子不同會產生易區分的表型性狀差異，因此，可通過測定殼長等特征性狀，分析南日島雙線紫蛤群體與其他地區自然種群同貝齡樣本的形態差異程度。

3.2 序列擴增

南日島雙線紫蛤個體的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS區和28S rRNA標記序列系統發育樹構建的過程中，部分序列在數據庫內暫未有種內同源序列，紫云蛤科內檢索到的種間同源序列條數未能滿足軟件建樹最低數量條件要求，故將該部分序列的分析比對范圍擴大至櫻蛤總科，因此依據不同標記序列所繪制的系統進化樹的結構不完全一致。DNA序列廣泛應用于海產經濟貝類如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[19]、牡蠣[20-21]、縊蟶[22]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[23]、魁蚶(S.broughtonii)[24-25]、泥東風螺(Babylonialutosa)[14]等的鑒定分類、群體遺傳和系統進化分析，根據雙線紫蛤8種序列與同源序列的聚類結果、遺傳距離值大小、與當前分類階元歸屬相對一致性與否，可選取COI標記基因對南日島雙線紫蛤群體樣本的較多個體進行測序，以了解本群體個體之間分子標記是否有變異，或結合其它地理群體樣本序列分析種內的變異情況。12S rRNA、Cytb發育樹中，產自南日島的雙線紫蛤序列和廣西北海的雙線紫蛤序列JN398363[13]聚在一起，但在16S rRNA、COI進化樹中，二者的基因序列卻沒有率先聚支。紫云蛤科16S rRNA系統樹中，南日島雙線紫蛤與疑似同種異名的亞當斯紫蛤[26]、同屬的中國紫蛤親緣關系更近，北海雙線紫蛤與同屬的中國紫蛤親緣關系最近，其次是亞當斯紫蛤，種間遺傳距離值均小于不同地理位置雙線紫蛤的種內距離；而紫云蛤科COI系統樹中，南日島雙線紫蛤能夠與同種的JN859948優先聚集，且二者與中國紫蛤的進化關系最近，其次為同屬的綠紫蛤，雙線紫蛤JN398363卻與蒴蛤屬的紅樹蒴蛤具有更近的親緣關系，其次才是中國紫蛤。序列聚類分析和遺傳距離值計算結果表明，雙線紫蛤南日島個體與廣西北海個體存在一定水平的遺傳差異，福建莆田和廣西北海的地理距離使得位于不同產地的雙線紫蛤基因交流遇到有效程度的阻礙，隨時間累積，逐漸穩定形成遺傳隔離，導致發生明顯的遺傳變異、分化，較大的種內遺傳距離揭示有可能存在亞種或隱存種。可在已獲得的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb基因片段基礎上，通過設計長片段引物擴增、拼接南日島雙線紫蛤線粒體基因組全序列，與雙線紫蛤JN398363進行線粒體基因組變異位點、堿基組成、氨基酸編碼、基因排列順序等情況做詳細的比較分析。綜合紫云蛤科16S rRNA和28S rRNA序列的種屬堿基組成、系統聚類、遺傳距離處理結果來看，基因數據同前人形態分類評價一樣，較傾向于支持紫蛤屬的S.diphos和S.adamsii為同種異名或隸屬于種的不同地理亞種，但最終分類關系的界定尚需二者群體樣本進化速率更快的ITS、COI、Cytb乃至線粒體基因組等的分析數據和其他高可信度的分子遺傳學資料共同佐證。

3.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤群體樣本的閉殼肌和斧足肌2種組織中所檢測的5種同工酶EST、IDH、LDH、MDH和ME在酶譜表型、分布和活性上均表現出明顯組織特異性，可能與雙線紫蛤2種組織的特異同工酶酶系統、組織結構生理功能和代謝途徑及強度有關，幾種同工酶的基因在閉殼肌細胞和斧足肌細胞中的調控表達不同而直接或間接表現出差異；個體間同一組織中IDH、LDH、MDH、ME和SOD酶系統譜型基本一致。EST在閉殼肌和斧足肌中皆染色出較多的酶帶、且酶譜表型相較其他幾種復雜，IDH在閉殼肌和斧足肌中酶活性均不強，LDH在閉殼肌中酶活性稍弱，在所用檢測條件下，6種同工酶中僅LDH在斧足肌中未顯示出酶活性或激活表達極弱、電泳后不能染出可見酶區帶，MDH、ME在閉殼肌中酶活性較強、尤其是ME酶帶染色最深，二者在斧足肌的酶活性較閉殼肌弱、酶帶顏色很淡；SOD在閉殼肌和斧足肌中都有表達、未呈現出明顯組織特異性和個體活性差異，2種組織間泳動遷移較慢的負染色彌散區譜型表達具有微弱不同，但在所調整的緩沖液體系配比、增加上樣量等多輪電泳及重復染色條件下，酶活性表達均不強，可能與條件不適、組織生理狀態、抗氧化防御性或新陳代謝水平相關聯，酶譜部分負染色區域沒有形成清晰的條帶或界限，無法比較組織特異性或個體多態性。閉殼肌IDH、LDH、ME和斧足肌IDH、LDH酶譜中均有出現2條遷移較一致的負染色條帶，極個別位點檢測到3條負帶，在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[27]、泥東風螺[14]等種群的遺傳變異分析中，類似現象亦有發現，可能是由于次生酶作用或蛋白無底物脫氫反應而產生的。EST、ME和SOD的個別酶帶較粗、拖尾或彌散，或許不只是單一酶帶存在，分子量相近仍需探索提高分離膠濃度、延長電泳分離時間等。6種同工酶的初步電泳分析中，EST酶活性在2種組織中顯示出良好的組織特異性及個體間豐富的多態性，個體基因選擇性表達的調控不同直接體現在同工酶產物變化，這種變化反映在種群內不同個體EST的酶帶表達增強或減弱而造成的條帶有無、活性強弱或數目差異，但共有酶帶泳動遷移位置未發生改變，表明南日島雙線紫蛤個體之間的遺傳分化因海區同質化環境和基因有效交流作用變異程度不是很高；EST的編碼位點較多，酶譜表型穩定重復性好，適于進一步研究南日島雙線紫蛤群體內同工酶多態性位點有無、多寡比例等指標，是進一步評價分析多種組織、不同貝齡、揭示群內個體或異地種群間遺傳差異的理想工具酶。

致謝：實驗得到中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室茅云翔教授、福建省水產研究所福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室曾志南研究員及福建省南日島海洋生物技術有限公司陳珍賜先生的諸多支持，特此致謝。

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