可口革囊星蟲室內自然產卵受精的研究

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(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門361013； 2.寧德市蕉城區漳灣鎮水產技術推廣站，福建 寧德352100)

可口革囊星蟲(Phascolosomaesculenta)，隸屬于星蟲動物門、革囊星蟲綱、革囊星蟲科，為我國的特有種，也是我國星蟲中產量較大的種類[1]。可口革囊星蟲主要生長在河口潮間帶的中、高潮海區，是經濟價值較高的養殖品種。寧德地區是福建省可口革囊星蟲主要產區，其灘涂養殖已成為當地的特色水產養殖產業，但因受天然苗種的限制，養殖規模一直未能擴大。目前，可口革囊星蟲苗種仍依靠海區人工采集，收集小規格個體作為苗種提供給養殖戶。近年受沿海灘涂開發利用以及過度采挖的影響，可口革囊星蟲資源量急速下降，人工采挖區也越來越分散，導致苗種成本不斷上漲。因此，該苗種大規模人工繁育技術的研究已逐漸引起重視。

獲得可口革囊星蟲受精卵方法有3種：陰干刺激、低溫刺激和自然產卵。目前，這3種方法在可口革囊星蟲和裸體方格星蟲生產試驗中，均有成功催產的報道。如陳慧等[2]、蘭國寶等[3]分別在可口革囊星蟲和裸體方格星蟲的育苗試驗中，采用陰干刺激方法進行人工催產，星蟲產卵并受精成功。吳洪喜等[4]選擇在砂濾海水暫養2 ～ 3 h可口革囊星蟲親體，然后瀝水置于恒溫箱中降溫(低于自然水溫8 ～ 10℃)刺激30 ～ 40 h，也取得較好的產卵、受精效果。而曾夢清等[5]、鄒杰等[6]采集星蟲親體，在鋪設泥沙質的水泥池中進行培育試驗，也都獲得產卵及受精。但從以上研究的結果來看，均存在產卵時間短、產后親蟲死亡率高及親體培育后期產卵量少等生產性問題。因此，本試驗利用自然海區采集的成熟親體，在室內人工培育條件下研究可口革囊星蟲繁殖期親體的懷卵量、產卵量、卵質及產卵規律，旨在總結一套人工培育催產的模式，為后期人工苗種的大規模培育提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 親體來源

可口革囊星蟲親體采自寧德市蕉城區三都澳海區。挑選健康、形態正常、體表無破損的親蟲約60 kg(平均個體體重4.61 g)，于2015年6月10日移入室內產卵池進行培育。由于性成熟個體的性別通過外觀較難以確定，因此在繁殖季節，往往通過體腔是否有卵子來判斷雌雄個體。在繁殖期取其體腔液，并用海水稀釋，取1～2滴于載玻片后，在光學顯微鏡下觀測并統計親體的雌雄比例。

1.2 養殖設施

試驗地點為福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地，室內水泥產卵池3個(3.5 m×3.5 m×1.5 m)，底泥取自龍海浮宮附近海區的中高潮地，為泥沙質，經曝曬、除雜后鋪于池底，池邊鋪設厚度約為15 cm，中部約10 cm，形成池邊高、中間低的鍋底形，并在池中留一條小溝，方便排干池水。試驗海水為經沉淀的蓄水池水，經沙濾后使用。

1.3 餌料

選用室外泥質池塘，施適量有機肥，培養底棲硅藻為親體餌料。不定期刮取池塘表層富含有機物和底棲硅藻的泥沙，排干水后均勻潑灑在親體培育池的泥面上。

1.4 方法

培育時間為2015年6月10日—2015年9月30日。培育期間環境因子均為自然狀況，親體培育水溫26～32℃，鹽度25～26，pH 7.6～8.5。產卵池每日上午08∶00排干池水，干露10～12 h，至傍晚后加滿池水。排水前要先檢查是否產卵及統計產卵數量，另取100粒卵置于200 mL燒杯中，測定其受精率。當日產卵數量大于10×104粒時，用200目的篩絹網收集后進行培育觀察。

定期檢查10～15條親蟲，觀測其體腔內胃腸飽滿度、卵細胞發育狀況并估算生殖力，由于可口革囊星蟲卵細胞數量較大，稱重后逐一解剖，體腔液放入燒杯中，加沙濾海水至100 mL，借助解剖鏡在計數板上計數，用體積法計算雌性個體體腔的卵細胞數量，并計算其相對懷卵量，其公式：相對懷卵量(粒/g)=個體懷卵總數(粒)/個體體重(g)。

2 結果

2.1 體重及雌雄比例

可口革囊星蟲雌雄以體腔液含有卵細胞或精細胞來區別，隨機抽樣100條親體，測得雌雄個體數分別為48條和52條，經卡方檢驗結果表明，顯示的檢驗顯著性水平為0.689(P>0.05)，可認為可口革囊星蟲自然群體雌雄比例是均勻的。雌性個體體重為3.03～7.84 g，平均體重為4.74 g；雄性個體體重為2.98～7.25 g，雌雄個體平均體重約為4.61 g。

2.2 體腔卵細胞數量

在繁殖盛期(7—9月)，可口革囊星蟲體腔卵子大小比較均勻，大部分卵子為大型卵子，卵略呈橢圓形，長徑約142 ～149 μm，短徑約121 ～132 μm。2015年7月10日，取樣并統計50條雌性可口革囊親體的懷卵量(表1)。從表1可以看出，卵細胞的數量與個體大小直接相關，懷卵量與個體體重的關系可描述為：y=-0.958 6x2+16.8x-19.827，相對懷卵量與體重的關系式為：y = -0.149 2x2+ 1.450 3x + 4.512 4(圖1)。

表1 可口革囊星蟲個體體重與懷卵量關系

編號Number體重/gWeight懷卵量/104粒Fecundity編號Number體重/gWeight懷卵量/104粒Fecundity12．8421．32264．5936．6323．7225．91278．0545．2033．4723．54283．9132．5244．0334．44295．4736．8653．2528．60303．5329．6064．8142．85314．0933．3577．5960．10323．9435．0088．1853．20333．4728．7595．3145．68346．3446．80107．8159．91353．5023．80116．3155．53363．9128．76127．1256．80375．4740．50134．8142．17383．5326．58145．5646．86394．0932．80155．8453．34403．9437．95164．0635．05414．1932．50173．6626．80422．8819．77185．0041．50434．4732．43

續表1

分析結果顯示，繁殖期間親體的懷卵量與個體體重成正比，懷卵量隨個體體重增加而增加，當體重在2.84～8.18 g之間時，絕對懷卵量為19.77×104～60.10×104粒。相對懷卵量則有所不同，在個體體重小于5.0 g時，相對懷卵量與個體的體重成正比，并隨個體體重增加而增加；當親體體重大于5.0 g時，相對懷卵量與個體的體重則成反比，且隨個體體重增加而逐漸下降。以全部測定的星蟲計，平均相對懷卵量約為7.66×104粒/g。由試驗結果可知，挑選可口革囊星蟲親體時，最佳體重為3.0～5.0 g，其生殖力也達到最佳水平。當然，不同海區的可口革囊星蟲群體是否有所差別，還有待進一步研究。

2.3 產卵

2015年6月10日從海區收集的可口革囊星蟲親體置于池中培育，至6月30日開始出現產卵現象，表明可口革囊星蟲已進入產卵期。親體的產卵行為大多數發生于午后4點，產卵斷斷續續，先產少量的卵，傍晚后產卵較為集中，一直持續到夜間凌晨1點基本結束，產卵行為一般持續6～8 h。親蟲的產卵自6月30日至9月22日共持續85 d(表2)，總產卵量為1 673.0×104粒，平均受精率為57.4%，其中最高為85.0%，最低為0%。隨后，7月份總產卵量為749.5×104粒，占全部產卵數量的44.8%；日最高產卵量為7月19日，產卵量為350.0×104粒，7月2日次之，產卵量為150.0×104粒。從產卵階段來看，有明顯的兩個高峰期，分別為7月2日—4日和7月18日—21日，兩個高峰期間隔約15 d。在產卵高峰期，也僅有一天產卵產量較大，其余天數產卵量相對較小，之后停止產卵數天，呈現明顯的間歇性產卵。日產卵量大于10×104粒的天數有9 d，0～10×104粒的天數有10 d，不產卵的天數有12 d。受精率變化范圍為0%～85%，受精率和產卵量有一定的關系，在日產卵量高時，受精率一般也相對較高，如7月2日、7月19日受精率分別為82%、85%，而產卵量少的日期，受精率一般也不高(圖2)。

表2 可口革囊星蟲產卵量和受精率

續表2

8月份親體的總產卵量為699.5×104粒，占全部產卵數量的41.8%；日最高產卵量在8月2日，達210.0×104粒，8月28日次之，產卵量為130.0×104粒，再次為8月16日，產卵量為95.0×104粒。從產卵的階段來看，有明顯的3個高峰期，分別為8月1日—3日、8月15日—17和8月27日—29日，間隔分別約15 d。產卵規律與7月份的類似，在產卵高峰期，也僅有一天產卵量較大，其余時間產卵量相對較小，之后停止產卵數天，呈現明顯的間歇性產卵。日產卵量大于10×104粒的天數有12 d，0～10×104粒的有6 d，不產卵天數最多，為13 d。受精率變化范圍為0%～75%，與7月份情況相似，受精率和產卵量有一定的關系，日產卵量高時，受精率一般也相對較高，如在8月2日、8月28日受精率分別為75%、72%，而在產卵量少的日期，受精率一般也不高(圖3)。

9月份總產卵量為221.0×10×104粒，占全部產卵數量的13.21%；日最高產卵量的時間為9月5日，產卵量50.0×104粒，9月17日次之，產卵量為30.0×104粒。從產卵的階段來看，有明顯的兩個產卵高峰期，分別為9月5日—8日、9月12日—20日，兩個高峰期間隔約7 d。與7、8月份比較，產卵量明顯減少，產卵數量不集中，呈無規律性。9月份受精率為0%～60%，明顯低于7、8月份(圖4)。

從整個產卵過程來看，親體產卵時間主要集中在7—8月，產卵量占86.79%，6月份產卵極少，9月份由于閩南地區臺風的影響，氣溫變化較大，水溫往往會發生下降現象，導致星蟲產卵量也明顯下降。從卵的質量看，7—8月的受精卵質量優于9月，培育效果明顯較好。

3 討論

3.1 生殖方式及雌雄比例

可口革囊星蟲為雌雄異體，體外無明顯的性征，體內無肉眼可見的生殖腺結構，生殖方式屬于典型分批排放類型*吳洪喜，陳琛，應雪萍，等.可口革囊星蟲的繁殖生物學與生活史[C]//2007年中國水產學會學術年會暨水產微生態調控技術論壇論文摘要匯編.北京：中國水產學會，2007：106.。可口革囊星蟲成熟的體腔卵子分一批或多批排完，親體產卵后并不會死去，而是在翌年再次生育產卵。由于可口革囊星蟲沒有第二性征，很難在外形上區別雌雄，但在生殖季節，可通過體色大致識別。如陳慧等[7]在可口革囊星蟲生殖周期的觀察過程中，發現在繁殖季節，雄性星蟲腎管聚集大量待排放的精子而變得相當膨大，外觀呈乳白色，可伸至體腔中后部，其直徑增大2～3倍，長度增長3～4倍；雌性星蟲腎管因受精卵母細胞膨大加粗而呈暗綠色，可伸至體腔中后部，其直徑增大3～4倍，長度增長4～5倍。蘭國寶等[8]在方格星蟲繁殖生物學研究中，也觀察到同樣現象，即在繁殖季節，成熟的個體可以通過半透明的體壁觀察腎管的顏色而加以區別。雄性個體腎管呈乳白色條狀，雌性個體腎管呈暗紅色條狀。

性成熟個體的性別比例在大多數月份很難確定。陳慧等[7]通過解剖取體腔液，在顯微鏡下觀察生殖細胞形態來區分雌雄。但在非繁殖季節，往往太多個體無法判斷雌雄，就是在繁殖季節，也有不少的個體因未達到性成熟而無法判別雌雄。蘭國寶等[8]在1999—2000年星蟲繁殖期季節中，隨機取樣檢查1 653條裸體方格星蟲，無法確定性別達175條，雌雄比例近似于1∶1。本次試驗挑選了體重大多在3 g以上的可口革囊星蟲個體100條，檢測發現雌雄性條數相差不大，雌雄個體數分別為48條和52條，接近1∶1。雖然個別星蟲可以依靠體色判斷雌雄，但大多數還是要通過觀察體腔生殖細胞來進行區分，也說明星蟲腎管收集卵子或精子的時間很短，可以通過體色來判斷雌雄的時間有限。

3.2 生殖力

生殖力在一定程度上反映了動物的繁殖方式。可口革囊星蟲卵子直接排出體外，體外受精，其產卵量可達數萬至十幾萬粒。本試驗觀察結果發現星蟲的生殖力隨個體的大小而異，較大的成體星蟲比小個體的懷卵量多，但年齡大的個體，懷卵量反而有所下降。這說明親體的懷卵量與其體重成正比，隨個體體重增加而增加，當體重在2.84～8.18 g之間時，絕對懷卵量為19.77×104～60.10×104粒。然而，相對懷卵量則有所不同，在體重小于5 g時，相對懷卵量與個體的體重成正比，隨個體體重增加而增加；在體重大于5 g時，兩者則成反比，即隨個體體重增加而逐漸下降。本試驗中測定的親體平均相對懷卵量約為7.66×104粒/g。懷卵量與個體體重的線性關系：y=-0.958 6x2+16.8x-19.827。相對懷卵量與體重的線性關系：y = -0.149 2x2+ 1.450 3x + 4.512 4。因此，開展可口革囊星蟲大規模育苗應挑選的親體體重在3.0～5.0 g為好，其生殖力可達最佳水平。當然，不同海區的可口革囊星蟲群體是否有所差別，還有待進一步研究。

本試驗中，可口革囊星蟲平均相對懷卵量達7.66×104粒/g，親體的產卵自6月30日至9月22日相對產卵量為0.027×104粒/g，總產卵量僅約占總懷卵量的0.71%。與裸體方格星蟲的懷卵量比較，鄒杰等[9]在2009年觀察到繁殖季節個體質量為7.33 g的雌性個體體腔液約2.8 mL，卵徑大于70 μm的卵細胞約2.5×104粒，而體質量為23.2 g的雌性個體體腔液可達13.8 mL，卵徑大于70 μm卵細胞數量可達17.7×104粒，其相對懷卵量為0.34×104～0.76×104粒/g；彭慧婧等[10]在對裸體方格星蟲的催產試驗中，挑選平均體重21.3 g的親體進行催產，6—8月的雌性裸體方格星蟲平均產卵分別為3.20×104粒、4.43×104粒和3.46×104粒，累計產卵達11.1×104粒，產卵量約占總懷卵量的60%。由此可見，不同種類的星蟲產卵情況存在較大的差異。

3.3 體腔卵細胞的變化

本試驗觀察發現，7—10月可口革囊星蟲體腔內的小卵組消失，體腔卵細胞卵徑分布較為一致，絕大多數為大卵型，呈現橢圓形。至11月以后，大型卵細胞開始退化，小型的卵細胞出現頻率增加。直到翌年2—3月，中型卵細胞才逐漸增多，這類同于劉懂等[11]發現在7—9月大部分的體腔卵細胞卵徑均在110 μm以上，其中130～150 μm的卵細胞約占2/3，11月后大卵徑細胞開始退化。但陳慧等[7]觀察到7—9月體腔為50～80 μm的個體的卵細胞占4.36%～12.07%，這可能與本試驗取樣的個體大小差別有關。

對于體腔卵子的變化，陳慧等[7]根據可口革囊星蟲卵母細胞發育過程的形態特征和存在形式，將其卵母細胞發育分為五個時期，分別為細胞增殖期、細胞質生長期、膠質膜形成期、成熟前期和成熟期。不同星蟲種類體腔卵細胞存在形式有所不同。Gonse等[12]報道法國Roscoff地區的G.vulgaris產卵期為6—9月，小型體腔卵細胞全年存在，并在產卵期以后出現生長停滯。郭學武等[13]發現裸體方格星蟲于5月進入繁殖季節，6—8月為繁殖盛期，體腔細胞不斷成熟并陸續產出；5—9月份體腔成熟卵細胞的數量比為173∶165∶96∶65∶9，成熟卵細胞所占的比例逐月減少；至7月，體腔有大量直徑小于40 μm的卵細胞，8月體腔內50～155 μm的卵細胞數量較多，并不斷地成熟并產出。與上述有所不同的是，可口革囊星蟲產卵季節為7—9月，期間的體腔細胞已發育成大型卵細胞，小型的卵細胞幾乎不存在；10月下旬，大型卵細胞數迅速減少(圖5)。可口革囊星蟲體腔卵子的形態為圓形或橢圓形，直徑在50 μm以下大多為圓形，50～100 μm時，大多為卵圓形或橢圓形，隨著卵子的發育，卵子的長短軸比例發生變化，卵子體積逐漸增加，進入到腎管的卵細胞，體型變為近圓形。

注：a.7月份體腔卵細胞；b.8月份體腔卵細胞；c.9月份體腔卵細胞；d.10月份體腔卵細胞。

Notes：a was coelomic oocyte in July；b was coelomic oocyte in August；c was coelomic oocyte in September；d was coelomic oocyte in October.

3.4 親體產卵次數和產卵量

可口革囊星蟲的產卵方式為分批成熟和多次產出類型。在繁殖季節的7—8月，從海區收集的成熟可口革囊星蟲，通過陰干刺激方法，可獲得受精卵。對于星蟲親體的培育模式，作者在裸體方格星蟲的親體培育及催產過程中取得比較好的經驗，在繁殖季節前2個月，即每年的4月，從海區收集健康的親體，經室內人工培育后獲得大量的受精卵。與繁殖期收集親體進行催產的效果相比，提前收集星蟲親體有較大的優點，一是成活率高，其可能的原因是如果親體在繁殖季節收集，期間海水溫度較高，在采捕、運輸過程中容易出現受損，而且處于繁殖期，親體的生理狀態比較活躍，易受外界環境的干擾；二是產卵時間長，培育的親體可在產卵池內連續產卵2～3個月。關于星蟲催產方法，如鄒杰等[6，14]在裸體方格星蟲催產試驗證明，繁殖期采集成熟的親蟲，星蟲親體首次大量產卵后，隔2～7 d經過繼續培育可二次自行產卵，二次產卵過后產卵量便下降甚至不再產卵，同時親體死亡數也大量增加。在之后的研究中，采用室內產卵培育和灘涂恢復養殖相結合的方法，即繁殖期內每次間隔1個月對同一批親體進行3次人工培育產卵試驗，雌蟲平均產卵量分別為3.11×104、2.70×104和1.75×104粒，也取得不錯的效果，但此方法操作比較困難，親體的死亡率也較高。

關于可口革囊星蟲水泥池人工培育試驗，目前仍未見報道。本試驗采用與裸體方格星蟲類似的培育方法，在室內開展人工親體培育。在試驗過程中，親體的成活率高，且在整個繁殖季節，產卵高峰間隔周期大概為15 d，這與裸體方格星蟲的室內培育產卵規律類似。蘭國寶等[8]觀察結果發現，裸體方格星蟲一般是在大潮期間排放受精卵。對于可口革囊星蟲催產，也開展了類似的試驗，定期從海區收集親體進行催產，經陰干刺激后幾乎每次都可以獲得受精卵。但在大潮期間，親體催產比較容易成功，產卵量也相對較高。這就進一步說明在自然海區，大潮期間親蟲體腔成熟卵所占的比例較高，催產效果較好。在小潮期間，催產效果不理想，產卵比較零散。其次，親體的產卵與水溫有明顯的關系，水溫較高時，星蟲產卵活動比較頻繁。如郭學武等[13]對廈門地區的裸體方格星蟲生殖周期的研究結果表明，在7—8月水溫最高時，星蟲產卵活動最旺盛。Rice等[15]也認為星蟲類的繁殖期一般都在當地海水溫度較高的季節，親體產卵往往在水溫較高的9—10月。

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