同位素稀釋-氣相色譜-質譜法測定河蚌蚌肉中鄰苯二甲酸酯類殘留量

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(新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830011)

鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是一類環境雌激素物質，主要作為塑料的增塑劑使用，同時被廣泛應用于建筑材料、化妝品、合成橡膠、洗滌劑、潤滑油和醫藥產品等各行業產品的生產過程中[1]。鄰苯二甲酸酯類化合物屬于高污染的一類環境激素污染物，具有不同程度的毒性，在人體內累積可導致生殖毒性、畸形、免疫毒性和神經毒性等嚴重危害[2-3]。目前有關 PAEs的研究多集中于環境樣品和塑料制品等方面[4-7]，隨著人們對食品質量安全的關注，學者將PAEs的殘留研究方向擴展到食品領域，其檢測方法主要為色譜法及色譜-質譜聯用技術[8-11]。

水產品作為人類食物的重要來源之一，其安全與人體健康緊密聯系。本次實驗選擇的研究對象為河蚌。河蚌屬雙殼類軟體動物，主要分布于長江中下游地區的淡水湖泊中，為中國特有資源[12]。已有相關文獻[13-15]報道我國長江與黃河兩大水域均存在較嚴重的PAEs污染，且該類化合物極易溶出并釋放進入環境體系，造成水質污染并通過富集進入水生生物體。由于河蚌的生長周期較長，主要生活在水體環境的底部，可通過吸收富集水體環境中的PAEs而存在健康風險，因此河蚌蚌肉中PAEs殘留量的監測工作逐漸引起研究人員的重視。

對水產品可食部位污染物的殘留檢測工作，前處理是整個實驗的關鍵部分，由于待測水產樣品可食部位油脂含量高，基質較為復雜，需要在前處理過程中應用固相萃取柱對色素、油脂和水分等進行凈化去除。本實驗通過優化樣品前處理條件，建立同位素稀釋-氣相色譜-質譜聯用技術測定河蚌樣品中7種PAEs的方法。采用同位素稀釋[16-18]的方法能夠很好地降低基質效應帶來的干擾，提高結果的準確度，在微量組分準確定量分析方面有很大優勢，符合殘留物的檢測分析和監控要求。可為PAEs在水體環境和水產品中的來源、分布及遷移過程的研究提供基礎數據，也為食品安全與人體健康風險潛在危害的暴露水平研究提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質譜儀(配電子轟擊離子源，美國Thermo公司)；分析天平(Mettle-Toledo 梅特勒-托利多)；旋轉蒸發儀(EYELA埃朗)；乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱(500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)；均質機(T18 digital，德國IKA公司)；離心機(CT18RT，上海天美公司)；冷凍干燥機(ZL-12TD ，上海左樂儀器有限公司)；實驗用水均為去離子水。

標準品：PAEs[鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)；D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP為內標物]化合物標準品(購自德國De.Ehrenstorfer公司)。

試驗樣品：人工養殖河蚌。

1.2 標準溶液配制

準確稱量7種PAEs標準品置于20.00 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配置成濃度為20.00 mg/L的標準儲備液，放置4℃冰箱中避光保存。將7種PAEs的單標混合并用正己烷稀釋至濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L的標準溶液(分別加入D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP，三種內標濃度均為0.50 mg/L)待用。

1.3 樣品采集與前處理

通過底網捕撈對河蚌進行樣品采集，采集后放置于帶有冰袋的保溫箱中運至實驗室，去殼取出可食用部分，用組織搗碎機將樣品勻漿處理后，迅速冷凍24 h，放入凍干機內-40℃進行冷凍干燥去除水分，備用。

1.4 實驗方法

試驗過程中為避免塑料制品中的鄰苯二甲酸酯對測試的干擾，均替換使用玻璃器皿，且經過色譜級的甲醇和正己烷浸泡潤洗，馬弗爐內高溫烘干。

準確稱取0.50 g樣品于50.00 mL玻璃管中，加入15.00 mL乙酸乙酯溶劑，渦旋振蕩3 min，低溫條件超聲萃取15 min，高速離心1 min，取上清液至濃縮瓶中，40℃減壓旋轉蒸發至約2.00 mL，轉移至Florisil柱凈化，用10.00 mL正己烷：丙酮(92∶8)混合溶劑洗脫目標物，收集洗脫液濃縮后用正己烷定容至2.00 mL，裝進樣瓶待測。

1.5 氣相色譜-質譜聯用條件

離子源：電子轟擊(EI)源，70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：270℃；色譜柱：HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.50 μm)；程序升溫：80℃，以20℃/min升溫至280℃，保持15 min；載氣：氦氣(99.999%)；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：260℃；進樣量：2.0 μL，不分流進樣；溶劑延遲：4.0 min；掃描模式和范圍：全離子掃描(Full scan)，50～450 amu。

2 結果與討論

2.1 同位素內標物的選擇

同位素內標物必須要與待測化合物有相似的結構，在樣品前處理過程及儀器響應上具有相同的性質，本試驗選用D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP三種同位素標記物作為內標物進行定量，通過色譜峰保留時間及選擇離子豐度比為目標化合物定性，進行實驗結果的測定分析。

2.2 質譜條件的選擇

質譜的定性和定量是以離子碎片為選擇依據的，根據PAEs化合物在EI模式下電離裂解的結果，選定檢測靈敏度較高且豐度較強的碎片離子作為定性離子，選擇基質干擾小的特征離子作為定性離子，質譜參數見表1。根據歐盟2002/657/EC指令[19]規定，對于質譜確證方法必須達到4個確證點的要求，PAEs化合物標準品及內標物的色譜圖及定量離子流圖見圖1。

表1 鄰苯二甲酸酯類的質譜參數

注：*為定量離子。

Note：The asterisk represented the quantitation ion.

注：特征峰(Peak identifications)1：DMP；2：DEP；3：DIBP；4：DBP；5：BBP；6：DEHP；7：DNOP；8：D4-DEP；9：D4-DIBP；10：D4-DEHP。

2.3 提取溶劑的選擇

樣品中PAEs殘留量檢測前處理常用的萃取溶劑主要有：二氯甲烷、乙腈、正己烷、乙酸乙酯。本實驗通過對比以上四種溶劑的萃取效率，參考組分的回收率和以色譜圖中基質干擾峰為依據，結果表明PAEs各個組分的萃取效率較為接近(圖2)，其中正己烷和乙酸乙酯的效果略高，由于乙腈極性較強，在萃取目標物的同時也會溶解部分基質，對色譜峰具有一定的干擾，而二氯甲烷的毒性較強，目前已逐漸被相似溶劑替代，本實驗綜合考慮后選擇乙酸乙酯作為樣品的萃取溶劑。

2.4 固相萃取柱的選擇

河蚌蚌肉的基質較為復雜，含有大量的脂肪、蛋白質和色素等物質，極易溶解在萃取溶劑中，從而干擾待測化合物的色譜分析，需要對雜質進行凈化處理，目前以吸附為主要目的的固相萃取(SPE)柱有N-丙基乙二胺(PSA)、C18、弗羅里硅土(Florisil)、中性氧化鋁(Al2O3-N)4種。其中PSA可去除樣品基質中的極性色素、糖類和脂肪酸等化合物；C18萃取柱作為反相吸附劑，能夠吸附樣品基質中的脂肪、脂質、甾醇等化合物；Florisil萃取柱是一種鍵合鎂吸附劑，能除去極性干擾物；Al2O3-N可吸附保留芳香族和脂肪胺類等含電負性基團的化合物。本實驗對比以上4種SPE柱對河蚌蚌肉樣品的凈化效果(圖3)，通過Florisil柱凈化后的樣品雜質峰較少，且回收率符合殘留分析的要求。

2.5 方法線性

在上述儀器條件下，對梯度濃度(0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L)的混合標準溶液進行測定，每種濃度進樣3次。在該范圍內以質量濃度與峰面積比(待測組分與同位素內標物峰面積比)作標準曲線并得到線性方程，相關系數r2均大于0.99，表明該方法具有良好的線性關系。

2.6 回收率、檢出限及精密度

對河蚌蚌肉樣品進行添加回收率試驗，分別進行3個水平(0.50、1.00、2.00 mg/kg)的添加回收試驗，每個添加濃度進行3個平行試驗。通過測定計算得出不同濃度的平均回收率在73.1%～94.3%之間，相對標準偏差(RSD)小于9.3%，該方法精密度良好。以3倍和10倍信噪比(S/N)作檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，結果表明本方法具有較高的靈敏度(表2)。

表2 河蚌樣品中鄰苯二甲酸酯平均回收率和相對標準偏差(n=3)

2.7 樣品測定

通過本試驗優化的前處理及儀器條件對河蚌進行PAEs含量測定，同時測定乙酸乙酯和正己烷試劑中PAEs的殘留量，檢測后發現正己烷試劑中有少量的PAEs檢出，考慮原因是封裝溶劑的塑料瓶蓋少量溶解到溶劑中，在扣除溶劑本底后，測定的河蚌樣品中僅有DEP和DBP兩種目標物殘留，殘留量在10～30 μg/kg范圍內，通過對養殖區域環境水樣中PAEs的調查研究，結果發現水體中存在DEP殘留，由此可見河蚌蚌肉中PAEs殘留的主要途徑是通過水體遷移和富集。

3 結論

本試驗通過優化前處理條件對河蚌蚌肉中PAEs進行檢測分析，結果表明7種PAEs在0.10～2.00 mg/L的濃度范圍內具有良好的線性關系，添加回收率試驗結果均高于70%以上，符合殘留量檢測的要求，可較準確地反映所測樣品的含量，可適用于大批量樣品的監測工作。由于河蚌的生長環境在湖底，因此后期將進一步對湖區的底泥中PAEs污染狀況進行監測，從而對污染物在整個環境中的遷移規律進行研究。

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