低溫對保加利亞乳桿菌C spA基因表達影響的研究

董至恒，石瑞文，包小妹，王玉華，張燁，關海濱，*

（1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部，內蒙古呼和浩特 010110）

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）屬于德氏乳桿菌屬保加利亞亞種，革蘭染色陽性、兼性厭氧、不移動、不產芽孢的乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）[1]，因其能賦予酸奶獨特的口味，目前被廣泛應用于酸奶的發酵。此外，保加利亞乳桿菌具有調節腸道菌群平衡、增強免疫力、抵御病原微生物的侵襲等生理作用，因此被廣泛應用于保健品及藥品的主要成分[2]。保加利亞乳桿菌可通過液體發酵的方法大量獲得，并通過冷凍干燥的方法制得菌粉，菌粉是菌種的最佳保存方式，因此可用作酸奶的直投式發酵劑、藥品以及保健品領域。

在工業生產過程中，凍干過程會對保加利亞乳桿菌造成嚴重損傷，主要表現在冰晶的形成對細胞膜產生的機械性損傷，蛋白質的變性失活，細胞膜通透性的改變，DNA損傷等因素[3-4]。然而菌體為了適應低溫環境，也會產生冷應激反應，生成一系列的抗低溫蛋白，即冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）來抵御低溫環境對菌體造成的損傷[5-8]。這是一類分子量約為7.5 kD的小分子蛋白，CSPs均為誘導型蛋白，在大腸桿菌中（E.coli）發現 9種 CSPs，其中 CspA、CspB、CspG、CspI 4種可被低溫誘導，其余CSPs在特定的生長期產生，CPSs家族約45%的序列具有同源性[9]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）的CSPs家族具有3種類似CspA的蛋白，分別為CspB、CspC、CspD，3種蛋白均可被低溫誘導產生，并且是菌體適應低溫環境所必須的[10]。CSPs具有多種生理功能，其結構包含2個保守的RNA結合區域，可結合RNA或單鏈DNA，可作為RNA的分子伴侶阻止RNA二級結構的形成，并可以作為翻譯的激活因子（Transcription activators）、翻譯抗終止子（Transcription antiterminators）或替代翻譯起始因子（Alternative translation initiation factors），促進蛋白的翻譯[9-12]。

本文對保加利亞乳桿菌進行低溫處理，以誘導冷休克蛋白的生成，通過熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的方法檢測CspA的表達，確定CspA的最佳誘導條件，并證明菌體的凍融存活率和凍干存活率與CspA的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）GD20150321：內蒙古醫科大學藥學院生物制藥實驗室保存。

1.1.2 試劑和儀器

MRS液體培養基：葡萄糖1.5%、酪蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉粉0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、吐溫-80 0.1%、MgSO40.05%、K2HPO40.05%。用5%的NaOH調節pH為6.6～6.8。

MRS固體培養基：MRS液體培養基加入1.5%的瓊脂。以上培養基121℃滅菌30 min，至4℃冰箱保存。所有試劑均為分析純。ViiA7型熒光定量PCR儀：美國ABI；Mini-sub cell GT電泳儀：美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的四級發酵培養

液體發酵培養采取四級培養的方法，一、二、三級為種子培養基，四級為發酵培養基，一級種子培養基接入凍干菌種，放置恒溫厭氧培養箱37℃靜置培養12 h。二級種子培養基由培養好的一級種子液按5%的接種量接入，培養8 h。以此類推，傳代到四級發酵。

1.2.2 發酵液活菌數的測定

采用平板混菌計數法，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）10 倍逐級稀釋發酵液至 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后吸取 1 mL 稀釋液加入到滅菌的空白平皿中，每個樣平行做3塊平皿，再倒入融化的50℃～55℃MRS固體培養基 15 mL～20 mL，搖勻，待培養基凝固后，將平皿倒置放于37℃恒溫厭氧培養箱中，培養48 h后計數，方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。

1.2.3 保加利亞乳桿菌的生長曲線測定

四級發酵液按不同的時間點（0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h）取樣，平板混菌計數法測定發酵液活菌數，制作生長曲線。

1.2.4 保加利亞乳桿菌CspA基因的克隆以及RTPCR法檢測mRNA的表達量

利用Prime5.0軟件設計RT-PCR法檢測CspA基因的引物，引物序列（F：5‘-TTGCCTTGTTCAACATCGTA’，R：5‘-GGGCTTTGGGTTTATCAC-3’），產物長度123bp，引物由Invitrogen公司合成。提取保加利亞乳桿菌總RNA，按 RNAiso Plus（D9108A Takara）試劑盒說明書方法操作，提取得到的RNA溶液，用酶標儀檢測OD260與OD280的比值，比值1.8～2.0為符合要求的RNA。

按照PrimeScript RT reagent Kit（DRR037A Takara）試劑盒說明操作，RNA 上樣量為 2.0 μL（約 500 ng），反應條件：37℃，15 min；85℃，5 s結束反應，獲得cDNA。

熒光定量PCR，按照SYBRPremixExTaq（DRR041A Takara）說明書方法操作，以cDNA為模板，加入CspA的引物，通過實時熒光定量PCR（Real time PCR，RTPCR）方法擴增CspA基因。反應條件：預變性95℃30 s；變性95℃5 s，退火60℃34 s讀板，共40個循環；從65℃到95℃制作融解曲線。以16srDNA為內參基因（長度210 bp），以確定CspA的相對表達量。產物做電泳檢測分析，并測序分析。

1.2.5 保加利亞乳桿菌低溫誘導CspA試驗

將保加利亞乳桿菌四級發酵液分別置于5、10、15、20、37 ℃的恒溫水浴中分別處理 0.5、1、2、4、6 h，即按照5組（溫度）×5組（時間）設計，共25組試驗，每組試驗設3個重復，37℃為對照組。RT-PCR法檢測CspA的表達量。

1.2.6 反復凍融法測定低溫誘導后保加利亞乳桿菌的存活率

將保加利亞乳桿菌四級發酵液分別置于10、15、20、37 ℃的恒溫水浴中分別處理 1、2、4、6 h，即按照 4組（溫度）×4組（時間）設計，共16組試驗，每組試驗設3個重復，37℃為對照組。并將菌液于-20℃以及25℃反復凍融8次，平板混菌計數法測定發酵液的活菌數，計算凍融存活率（凍融后的活菌數/凍融前的活菌數）。

1.2.7 保加利亞乳桿菌凍干驗證試驗

保加利亞乳桿菌四級發酵液經10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集菌體，加入凍干保護劑（凍干保護劑：25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸）混勻，-40℃預冷30 min，真空干燥24 h得到凍干菌粉。精密稱取1.00 g菌粉懸溶于10 mL PBS中混勻，平板混菌計數法測定混懸液的活菌數。為了考察低溫誘導和凍干保護劑對菌體抗凍性的影響，發酵液按照最佳溫度和時間進行低溫誘導處理，試驗分為4組，每組設3個重復。（A）空白對照組、（B）加保護劑組、（C）低溫誘導組、（D）保護劑+低溫誘導組，計算各組樣品的凍干存活率（凍干菌粉總活菌數/發酵液總活菌數）。

1.3 數據處理

RT-PCR所獲得的數據，利用2-ΔCt（擴增循環數）（ΔCt=CspA Ct值－16srDNA Ct值）公式進行 CspA基因在保加利亞乳桿菌中相對表達量計算。

試驗數據均采用平均值和標準誤差（SEM）表示，應用Tukeytest檢驗進行分析，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 保加利亞乳桿菌生長曲線結果

保加利亞乳桿菌生長曲線如圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus

如圖1所示，保加利亞乳桿菌生長良好，0～2 h是菌體的適應期，2 h～6 h是菌體的對數生長期，6 h～12 h是菌體的穩定生長期，12 h～20 h菌體進入衰退期。

2.2 保加利亞乳桿菌CspA基因克隆及電泳結果

保加利亞乳桿菌CspA基因克隆電泳結果見圖2。

圖2CspA基因RT-PCR電泳結果Fig.2 Electrophoresis result of CspA RT-PCR product

如圖2所示保加利亞乳桿菌CspA基因克隆片段，大小為123 bp，產物經電泳、膠回收、測序、測序結果在Genbank上比對，確認為目標基因。

2.3 保加利亞乳桿菌低溫誘導CspA試驗結果

低溫誘導后CspA mRNA的相對表達量見圖3。

圖3 低溫誘導后CspA mRNA的相對表達量Fig.3 Relative mRNA expression of CspA after low temperature treatment

如圖3所示，保加利亞乳桿菌四級發酵液在不同的誘導溫度（5、10、15、20℃）條件下，以及不同的誘導時間（0.5、1、2、4、6 h）條件下，并以 37 ℃作為對照，RT-PCR法檢測菌體CspA mRNA的表達量。用SPSS17.0軟件對數據進行分析，結果顯示，在37℃時，不同的時間內其表達量沒有顯著變化，說明時間不會對CspA mRNA的表達量造成影響。而在低溫誘導下，菌體CspA mRNA的表達量均有不同程度的提高，說明低溫可以誘導菌體產生CspA，且在20℃誘導4 h，菌體CspA的表達量最高，且差異顯著（P＜0.01）。

2.4 反復凍融法測定低溫誘導后保加利亞乳桿菌的存活率結果

不同誘導時間和溫度條件下，低溫誘導后菌體的凍融存活率見圖4。

圖4 不同誘導時間及誘導溫度條件下菌體的凍融存活率Fig.4 Freeze-thawing survival rate of cells after low temperature treatment with the condition of different administration time

保加利亞乳桿菌四級發酵液在不同的誘導溫度（10、15、20℃）條件下，以及不同的誘導時間（1、2、4、6 h）條件下，并以37℃作為對照組，平板計數法檢測發酵液的活菌數，并計算凍融存活率。用SPSS17.0軟件對數據進行分析。如圖4所示，在37℃時，菌體的存活率隨著凍融循環次數的增加而顯著降低，經過8次凍融循環后，菌體存活率為14%，差異顯著（P<0.01）。而在低溫誘導下，菌體的凍融存活率明顯高于對照組，說明低溫誘導可以明顯提高菌體的抗凍性，并且在20℃、4 h條件下菌體的凍融存活率最高，經過8次凍融循環后，存活率達64%，差異顯著（P<0.01）。

2.5 保加利亞乳桿菌凍干驗證試驗結果

在保加利亞乳桿菌凍干過程中通常需要加入一定量的保護劑，以減輕凍干對菌體的損傷，為了考察CspA對菌體凍干的保護效果，以及CspA與凍干保護劑對菌體凍干的協同保護作用，將試驗分為4組，A空白對照組、B加保護劑組、C低溫誘導組、D保護劑+低溫誘導組，以A組為對照，對比其它組的凍干相對存活率。平板計數法檢測凍干菌粉的活菌數，并計算凍干存活率。用SPSS17.0軟件對數據進行分析。結果見圖5。

圖5 菌體凍干存活率驗證結果Fig.5 Testify result of freeze-drying survival rate of cells

如圖5所示，A組的凍干存活率約為12%；B組加入凍干保護劑后其相對凍干存活率約為32%，說明凍干保護劑對菌體的存活率起到了明顯的效果；C組中菌體經低溫誘導產生CspA后，其凍干存活率約為29%，說明CspA可以保護菌體減少凍干對菌體的損傷；D組加入凍干保護劑并低溫誘導菌體，其凍干存活率約為57%，差異顯著（P<0.01），說明凍干保護劑和CspA具有協同或相加的作用，共同保護菌體，提高了菌體的抗凍性。

3 討論

冷休克蛋白在細胞水平上發揮了重要作用，CspA的mRNA能在低溫條件下表達，并且翻譯出CspA蛋白，CspA可作為轉錄因子促進冷誘導基因的表達，并且CspA還可結合單鏈DNA及RNA，從而影響其基因表達功能[1，13-15]。研究顯示，對嗜熱鏈球菌進行20℃、4 h的低溫處理，其存活率可提高1 000倍[16-17]。枯草芽孢桿菌經18℃低溫處理后，有大約50種參與氨基酸與核酸合成的mRNA的表達降低，同時約50中mRNA的表達升高，表達最強的是脂肪酸脫氫酶基因，其作用是將飽和脂肪酸脫氫成為不飽和脂肪酸，增強細胞膜的流動性，從而提高抗凍性。

本研究對保加利亞乳桿菌進行不同溫度和時間的低溫處理，以考察CspA的最佳誘導條件，并考察菌體的凍融存活率和凍干存活率，結果發現，在20℃、4 h誘導條件下其CspA的表達量最高，且低溫誘導可以顯著提高保加利亞乳桿菌的凍融存活率和凍干存活率，說明CspA在抵御低溫對菌體的損傷、提高凍融存活率和凍干存活率方面發揮了重要作用。由此可知，在發酵結束后，對保加利亞乳桿菌進行低溫誘導，促進其CspA的表達，可以明顯提高菌體的凍干存活率，提高凍干菌粉的活菌數，對于菌粉的工業生產有一定的指導意義。

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