基于Miseq測序初步分析興安落葉林外生菌根菌的生態分布

烏仁陶格斯，王 娟

（呼和浩特民族學院 環境工程系，內蒙古 呼和浩特 010051）

外生菌根是真菌的菌絲包被在植物幼嫩細根外形成的菌套和在細胞間形成哈帝氏網結構與宿主植物細根形成的共生體[1-3].Miller（1982）統計結果顯示，世界上能形成外生菌根的真菌有約5000種[4].我國已經報道的外生菌根菌約520種，隸屬于子囊菌和擔子菌2個亞門，41科77屬[5].外生菌根是在北方森林喬木樹種菌根中的主要類型，在森林生態系統中起著非常重要的作用[6].

興安落葉松（Larix gmelinii）是寒溫帶森林主要建群種，也是重要的用材針葉樹種.內蒙古大興安嶺林區是我國最重要的國有林區之一，同時是我國北疆重要生態屏障.為加快改善森林生態環境，前人對大興安嶺森林植被與生物多樣性保護方面做了大量的工作，尤其是在外生菌根菌資源調查、生態功能研究方面取得了一定的成果[7].研究表明，落葉松林下土生大型真菌中外生菌根真菌占94.45%[8].樊永軍（2009）報道了與興安落葉松共生的外生菌根菌14種[9].本文運用Illumina MiSeq測序平臺，以大興安嶺落葉松為研究對象，初步調查分析大興安嶺興安落葉松外生菌根菌生態分布，為外生菌根菌生態分布與環境因子的互作規律研究提供參考.

1 研究區概況

內蒙古大興安嶺國家級森林生態系統定位研究站位于內蒙古大興安嶺北部根河林業局境內，地理坐標為東經121°30′～121°31′，北緯 50°49′～50°51′，海拔 800m～1100m.該區屬寒溫帶濕潤氣候區.主要森林植被有興安落葉松（Larix gmelinii）為主，伴生種有白樺、山楊、杜鵑等.土壤類型為灰棕壤.

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

于2015年8月，在內蒙古大興安嶺國家級森林生態系統定位研究站興安落葉松林地，在試驗區內選定的5個樣地、每個樣地設3個采樣點，采集根際0cm～30cm深的土壤樣品，分別取10cm×10cm×10cm帶細根土樣裝入塑料袋中并編號，密封，并認真填寫好野外調查表（包括海拔、經緯度等）.將土樣帶回實驗室，置于-20℃冰箱中保存.將每個樣地3個采樣點的土樣進行混合，此混合土壤樣品作為DNA提取的樣品，分別編號為 TX1、TX2、TX3、TX4、TX5.

2.2 實驗方法

土樣總DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA（具體DNA提取步驟按照說明書進行）.

基因組的PCR：

選用引物 真菌ITS檢測擴增引物ITS1和ITS4

PCR 反應體系 5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，Forward Primer(5μmol/L)0.8μL，Reverse Primer(5μmol/L)0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng；補ddH2O至 20μL.

PCR反應程序 預變性95℃ 2min；循環95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，30 個循環；72℃延伸 5min.

PCR實驗鑒定 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，取2μL上樣量進行檢測.

測序與數據處理 將PCR產物利用Ilumina Miseq PE250進行測序.然后根據測序結果，整理、過濾原始數據，獲取優質序列，并進行對比和統計分析.

3 結果與分析

鑒定結果表明，興安落葉松采樣地外生菌根菌分屬于擔子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota 2個門，傘菌綱Agaricomycetes、節擔菌綱Wallemiomycetes、盤菌綱Pezizomycetes、圓盤菌綱Orbiliomycetes 4個綱，革菌目Thelephorales、傘菌目 Agaricales、牛肝菌 Boletales、蠟殼耳目Sebacinales、紅菇目 Russulales、阿太菌目 Atheliales、盤菌目Pezizales、圓盤菌目Orbiliales 8個目.其中傘菌目最多，優勢菌目依次為傘菌目Agaricales、紅菇目Russulales、牛肝菌Boletales. 在科水平上，Thelephoraceae、Sebacinaceae、Pyronemataceae、Inocybaceae、Suillaceae、Cortinariaceae、Russulaceae、Atheliaceae分別占所選真菌總數的8.14%、5.17%、2.86%、2.73%、1.38%、1.03%、0.72%、0.55%（詳見表1）.

從興安落葉松5個樣地所采的土壤樣品測試分析結果來看（如表1和表2所示），優勢菌屬主要為錦革菌屬Tomentella、絲膜菌屬 Cortinarius、紅菇屬 Russula、乳菇屬（Lactarius）、乳牛肝菌屬 Suillus.在每個采樣地（TX1、TX2、TX3、TX4和TX5）出現的外生菌根菌種數依次為34、32、28、26和39種，其中每個樣地均出現的外生菌根菌種有6種，如Russula versicolor、Russula citrinochlora、Lactarius vietus、Suillus paluster、Suillus spectabilis、Pseudotomentella tristis，TX5樣地出現的菌種最多.

表1 所采樣樣地興安落葉松主要外生菌根真菌科屬水平統計

表2 鑒定到種的興安落葉松外生菌根菌組成分析

續表

4 結論與討論

本文采用Illumina MiSeq測序技術，對興安落葉松外生菌根真菌進行了較全面的檢測.從結果分析可知，興安落葉松外生菌根菌類型較多，鑒定到2個門、4個綱、8個目.在科水平上，革菌科、蠟殼耳科、火絲菌科、絲蓋傘科、乳牛肝菌科、絲膜菌科、紅菇科所占比例較高.其中鑒定到種的共有53類型，如絲膜菌屬21種、紅菇屬13種、乳牛肝菌屬5種、棉革菌屬4種、乳菇屬4種、絲蓋傘屬3種、擬棉革菌屬1種、蠟殼耳目屬1種、地孔菌屬1種.從菌根共生關系來看，這些多種類型的外生菌根菌能夠幫助落葉松的生長及發育，提高它對不利環境的適應能力.

研究表明，在森林砍伐區內地上和地下部分的不同外生菌根菌豐度有所區別[10].外生菌根真菌的分布與溫濕度林下光照、林齡以及撫育間伐等環境干擾因子有關[11].目前，外生菌根真菌分布的調查方法多樣，選擇不同的調查方法可能會影響研究結果.本研究利用Illumina Miseq測序平臺，18SrRNA基因擴增子技術成功地檢測了興安落葉松真菌多樣性，通過統計分析獲得了大量的、較全面的外生菌根真菌信息.本次調查發現，在興安落葉松不同樣地土壤樣品中的出現的外生菌根菌種類型各不相同，且外生菌根菌鑒定結果與樊永軍（2009）[9]研究結果有所差異.說明，興安落葉松林下外生菌根真菌分布較廣，在維持生態系統穩定性中起到非常重要的作用，但由于所采用的調查方法、調查時間、選擇樣地的不同或環境干擾因子的影響等多種原因，引起其在土壤樣品中存在種類、數量的差異.

〔1〕James M,Trappe.A.B.Frank and mycorrhizae：the challenge to evolutionary and ecologic tueory[J].Mycorrhiza,2004,15(14)：277～281.

〔2〕劉潤進,陳應龍編著.菌根學[M].北京：科學出版社,2007.

〔3〕烏仁陶格斯,韓勝利,閆偉.淺析土生空團菌(Cenococcum geophilum Fr.)自然侵染率與植被、根際土壤因子的關系[J].中國農學通報,2012,28(25)：47～51.

〔4〕弓明欽,陳應龍,仲崇祿.菌根研究及應用[M].北京：中國林業出版社,1997.

〔5〕馮云利,桑蘭,吳素蕊,等.外生菌根菌研究概況[J].中國食用菌,2013,32(6)：1～3.

〔6〕Pierre-Emmanuel C,Marc B,Abdala G D,et al.The role of ectomycorrhizal communities in forest ecosystem processes：New perspectives and emerging concepts[J].Soil Biology&Biochemistry,2010,42：679～698.

〔7〕韓勝利,張秋良,安慧君,等.興安落葉松天然林空間結構特征分析[J].干旱區資源與環境,2015,29(5)：87～92.

〔8〕祁亮亮.東北地區落葉松林下大型真菌多樣性研究[D].東北師范大學，2016.3.

〔9〕樊永軍.內蒙古地區四種樹木外生菌根形態多樣性及分子鑒定[D].內蒙古農業大學，2009.4.

〔10〕Byrd KB,Parker VT,Vogler D et al.The influence of clear-cutting on ectomycorrhizal fungus diversity in a lodgepole pine(Pinus contorta)stand,Yellowstone National Park,Wyoming,and Gallatin National Forest,Montana[J].Canadian Journal of Botany,2000,78(2)：149-156.

〔11〕陳曉,白淑蘭,劉勇,等.撫育間伐對油松人工林下大型真菌的影響[J].生態學報,2013,33(21)：6935～6943.