農作物種子轉基因成分實時熒光PCR盲檢技術要點與應用

辛 艷，劉 何，常雪艷，周 瑩

（天津市種子管理站，天津 300061）

近年來，隨著轉基因農作物商品化推廣進程加快，農業部和各省市種子質量監管部門下達的抽查監督檢驗任務都要求進行轉基因成分的定性檢測。因此，省級以上種子檢測機構需要加快建立大批量農作物種子樣品轉基因檢測技術平臺，為轉基因農作物市場監管提供技術保障。目前，實時熒光PCR定性檢測法已逐步列為農業和出入境檢驗檢疫部門的行業標準，并逐步成為各級轉基因檢測機構重要方法。

1 TaqMan探針技術在轉基因成分檢測方面應用原理

TaqMan探針技術是美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實時PCR定量技術[1]。TaqMan探針技術應用于轉基因成分檢測，是根據使用頻率最高的篩選基因即啟動子、終止子等調控元件或外源基因作為檢測靶標，設計特異性引物和熒光探針，在對樣品DNA進行PCR擴增的過程中，實時熒光定量PCR儀根據熒光信號的積累與PCR擴增產物形成同步的關系實時監測整個PCR進程，再通過擴增曲線對檢測模板DNA進行定性分析，判定樣品中是否含有外源基因[2]。

2 TaqMan探針技術特點

TaqMan探針技術融匯了PCR靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜定量的準確性，將熒光標記技術、激光技術、數碼顯像技術融為一體，具有特異性和準確性強、靈敏度高、假陽性低、重復性好、定量范圍寬、檢測效率高等特點。另外，實時定量PCR儀操作簡單、安全、自動化程度高，PCR擴增和檢測在全封閉的同一反應管內進行，能有效減少核酸擴增產物的交叉污染，而且擴增和檢測一步完成，不需要電泳等PCR后期處理，更避免了電泳染色劑EB、放射性同位素或揮發性有害物質如甲醛等對檢測人員的傷害[3]。

目前，我國針對已批準的轉基因農作物品種中使用頻率最高的調控元件，如啟動子CaMV35S、終止子NOS及通用于多種主要農作物的抗蟲基因Cry1Ab/c、耐除草劑基因EPSPS等，設計出30多對特異性引物和相應的熒光探針，陸續建立了多種農作物轉基因成分實時熒光PCR檢測方法的行業標準。該方法可快速準確地檢測出國內外主要商品化轉基因品種，涉及主要農作物包括玉米、大豆、水稻、油菜、棉花等。表1是出入境檢驗檢疫行業標準中轉基因作物的主要篩選基因[2，4-7]。

表1 出入境檢驗檢疫行業標準中玉米、大豆、水稻、油菜、棉花的篩選基因

3 TaqMan探針技術檢測轉基因成分技術流程與操作要點

3.1 樣品預處理

檢測樣品前要充分混勻，根據樣品特性選擇研磨方式。淀粉類種子如玉米種子取20粒，水稻種子30～40粒，直接用球磨儀或組織研磨儀研磨；含油成分較高的如棉花、油菜等可在研磨的樣品中加入1 mg左右的硼砂，防止樣品在研磨中粘在一起。還可將種子培養至發芽，取發芽的第一葉部分用液氮研磨。

樣品的預處理過程中應注意研磨罐或研磨坩堝及取樣器具每用一次必須清潔干凈且干燥，確保無任何污染、樣品間的機械混雜及樣品組分的改變。

3.2 DNA提取及其質量測定

選擇CTAB法、SDS法、試劑盒法都是行業標準推薦的DNA提取方法。對于大批量農作物種子樣品，既要在有限時間內完成任務又要保證DNA提取質量，采用DNA提取試劑盒法是符合要求的好方法。該方法污染較少，效率高，提取濃度在20～100 ng·μL-1，3 h內可提取20～30個樣品的DNA。CTAB法和SDS法可獲取較高濃度的DNA，但這兩種方法提取時間長，效率低，易污染，且要用到易揮發的有毒試劑，不適合大批量樣品提取。

DNA質量的檢測可以用瓊脂糖凝膠電泳法、紫外分光光度計和超微量紫外分光光度計來測定。高質量的DNA在瓊脂糖凝膠電泳上顯示的是清楚明亮的單一條帶，如果出現彌散拖尾的條帶則說明DNA質量不好或有降解。使用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，比用瓊脂糖凝膠電泳法更加便利，迅速，檢測結果直觀。稀釋部分DNA，測定并記錄其在260 nm和280 nm的紫外吸收率。以一個OD260相當于50 μg·mL-1DNA濃度來計算DNA濃度。以OD260/280值表示DNA樣品純度。OD260/280值在1.7～2.0說明DNA純度較好；若OD260/280值小于1.7可能有蛋白質殘留，也可能是用去離子水洗脫的原因；若OD260/280值大于2.0，可能有RNA污染或DNA降解。

3.3 平行樣與對照的設置

檢測樣品設2個平行樣；每次檢測必須設立3個對照，一是陽性目標DNA對照，為可溯源的標準物質提取的DNA；二是陰性目標DNA對照，為非轉基因農作物樣品DNA；三是試劑空白對照（不含DNA模板）。同時檢測內源基因，每次檢測要設立3次重復。

3.4 檢測流程

轉基因成分的檢測對象包含啟動子、終止子、外源目的基因或標記基因事件。對大批量種子樣品的轉基因成分定性檢測，先進行啟動子和終止子的篩查，篩查結果為陽性的樣品再進行功能基因或標記基因的篩查。例如，轉基因玉米的定性篩查，只要檢測啟動子P-CaMV35S，終止子T-NOS，篩查率就可達99%。考慮到功能基因的分布，加上 BAR、PAT、NPTII、Cry1Ab/c、gat等元件，轉基因玉米的檢測覆蓋率可達2次以上，大大降低漏檢風險。

3.5 引物和探針濃度要求

引物和探針的濃度影響反應的特異性。引物和熒光探針按照行業標準公布的序列購置，按照產品說明用TB緩沖液或去離子雙蒸水配制成100 μmol·L-1母液保存于-20 ℃，應用時引物配制成10～20 μmol·L-1工作液，探針配制成5～10 μmol·L-1工作液。熒光PCR反應的引物終濃度為0.1～0.6 μmol·L-1，探針終濃度為0.05～0.30 μmol·L-1。體系中引物與探針濃度低會導致反應不完全，濃度高則會產生非特異性產物。

3.6 熒光PCR緩沖液的要求

熒光PCR反應最好使用市售的專用qPCR混合液。一般專用qPCR混合液是2倍濃度；熒光PCR反應體系要求的終濃度為1倍。如果自行配制qPCR體系混合液，25 μL體系中，PCR緩沖液終濃度為1倍，dNTP終濃度為0.2 mmol·L-1，濃度過低會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低，進而影響Taq酶發揮最佳活性；Mg2+終濃度為2.5 mmol·L-1，Mg2+的濃度高會增加非特異性擴增；Taq酶終濃度為2.5 U,濃度高也可引起非特異性擴增，濃度低則合成產物量減少。

3.7 模板DNA濃度

模板DNA的質量會影響PCR擴增的效率。最初提取較高濃度的DNA母液應在-20 ℃保存，避免反復凍融。稀釋部分DNA，以濃度20～50 ng·μL-1作為工作液分管保存，用TE緩沖液溶解和稀釋模板DNA能延長保質期。在25 μL體系中，模板DNA濃度在20～50 ng·μL-1下，取2.0～4.0 μL均可擴增出相應產物。

3.8 實時熒光PCR反應的條件設置

轉基因篩選實時熒光PCR的參數設置條件依儀器不同稍有改變，一般為50 ℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。引物與探針的退火溫度極其重要。一般探針的退火溫度（Tm值）比引物高10 ℃。經實驗研究發現，適宜的退火溫度為55～60 ℃，以確保引物在延伸時探針保持與目標序列的結合。轉基因篩選實時定量PCR反應一般設置為25～40個循環。只有極微量的待測樣本，適當增加循環數以提高反應的檢出底限，可以將循環數增加至45。實際上，當循環數增加到某一值時，反應曲線趨于平線，不再升高。

3.9 實時熒光PCR儀操作要點

3.9.1 反應板的設置

3.9.2 上樣操作

3.1 0 實時熒光PCR結果分析

實時熒光PCR的結果的判斷首先要設置無效基線范圍。基線范圍選擇在3～15個循環，與熒光通道無關。人為設置的熒光信號閾值（Ct值），原則上要大于樣本的熒光背景值和陰性樣品擴增曲線的最高值，同時盡量選擇進入指數期的最初階段。農作物轉基因成分檢測Ct值為一般以40為準。

內源基因的檢測是可以驗證PCR反應體系中是否存在抑制物質，以避免檢測結果的假陽性。不同農作物實時熒光PCR方法的行業標準，其內源基因檢測Ct值規定不同。以轉基因玉米檢測為例，內源基因檢測的臨界值為24。內源基因檢測Ct值均小于或等于24時，當設置的陰性與空白對照結果正常情況下，待測樣品每個重復檢測的Ct值均小于或等于36，判定該樣品檢出外源基因；待測樣品各重復的Ct值大于或等于40，判定該樣品未檢出外源基因；如果待測樣品各重復的檢測Ct值在36～40之間，需要重做，并考慮調整模板DNA加入量。再次擴增后在設置的各對照結果均正常情況下，待檢樣品Ct檢測值仍小于40，則可判定該樣品檢出外源基因；Ct檢測值大于40，則可判定該樣品未檢出外源基因[4]。

Ct值的大小還與模板DNA的濃度相關。適宜的DNA模板量是內源基因檢測的Ct值在15～36之間，外源基因的檢測Ct值在27～36之間。Ct值小于15時，應減少模板DNA量；而Ct值超過40時，表明PCR過程中沒有目標DNA擴增；在Ct值在36～40之間時，且各平行樣的檢測結果差異很大，說明模板DNA在PCR反應體系中的含量很少，需要增加模板量或提高模板DNA濃度[4]。

4 多重熒光PCR技術在轉基因元件篩查方面的探索

多重熒光PCR是對多個（1個以上）目的基因同時做熒光PCR檢測。設計多重熒光PCR要考慮五個因素， 一是特異性引物和探針的組合要求。所設計的引物退火溫度Tm值接近相同（55～60 ℃），相應的探針的Tm值接近相同，約高于引物Tm值5～10 ℃，且不同引物及探針之間不能互補。建議用Beacon Designer、Primer Premier 5.0或 Oligo 6.72 軟件設計多重反應的引物與探針組合；二是多重熒光PCR實驗要求使用多個報告基團來追蹤每個靶標的擴增反應，為區分每個反應，應選擇發射波長最小限度重疊的熒光報告基團；三是多重熒光PCR反應要求的模板DNA的濃度和純度較高，濃度要求在150～300 ng·uL-1,純度要求在1.8～2.0之間。普通DNA提取試劑盒所提取的DNA達不到要求，使用改良的CTAB[8]法會得到較高濃度和純度的DNA；四是多重熒光PCR體系最好專用qPCR混合液，因為其緩沖液、DNA聚合酶及dNTP的配比良好，還具有PCR反應的增強劑和穩定劑，可以提高反應效率。五是建立多重實驗的先要優化單重引物/探針反應，使其擴增效率達到90%以上；然后在同一反應板上進行靶序列的單重和多重試驗，如果單重與多重的靶序列Ct值差異不明顯，則說明體系中各成分加量合適，反之則需要優化反應，通過調節反應預混液、引物/探針、模板DNA的加入量來實現。

多重熒光PCR技術在病原菌檢測、病毒檢測方面的應用報道較多，在轉基因成分定性與定量檢測方面的報道還不多。董進法[9]設計了P-35S和T-NOS多重熒光PCR體系，成功將轉基因大豆與非轉基因大豆分開；劉光明等[10]也設計出了35S啟動子和NOS終止子的雙重特異性引物，利用多重熒光PCR同時檢測了大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等11份樣品中的CaMV35S和NOS轉基因成分。付偉等[11]針對大豆內源基因Lectin和轉基因大豆DAS44406-6品系的5’端插入序列設計特異性引物及探針，建立了同時檢測大豆內源基因Lectin和轉基因大豆DAS44406-6品系的雙重熒光定量PCR方法并運用于15種轉基因大豆和非轉基因大豆的特異性評價，其靈敏度達到0.01%。可見實時熒光多重PCR在轉基因定性與定量方面值得進一步研究和推廣。

5 實時熒光PCR技術展望

利用實時熒光PCR檢測方法對大量盲樣進行篩查，既提高檢測效率，又降低檢測成本，而且準確性高，該方法可廣泛用于農作物種子質量監督抽查大批量盲樣的轉基因成分檢測。但越來越多的轉基因作物采用全新的啟動子、終止子和標記基因，利用已公布的引物和探針做檢測就會有一定的局限性，這就需要不斷開發新型的特異性引物和熒光探針，將來轉基因成分篩查基因也會更多。若該技術與生物芯片、免疫磁珠、色譜技術、光譜技術和微解剖技術[12]等各類技術聯合開發使用，實時熒光PCR技術在轉基因成分檢測方面的應用前景必將越來越廣闊。

[1]袁繼紅.實時熒光定量PCR技術的實驗研究[J].現代農業科技，2010（13）：20-22.

[2]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T2584—2010 水稻及其產品中轉基因成分實時熒光檢測方法[S].

[3]許安君.實時熒光定量PCR技術在糧油轉基因成分檢測中的應用[J].糧油食品科技，2013（2）：68-70.

[4]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準，SN/T1196—2012 轉基因成分檢測 玉米檢測方法[S].

[5]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準，SN/T1197—2016 油菜中轉基因成分 普通PCR法和實時熒光檢測方法[S].

[6]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準，SN/T1199—2010棉花中轉基因成分定性檢測方法[S].

[7]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準，SN/T 1195-2003 大豆中轉基因成分的定性PCR檢測方法[S].

[8]Markus L, Peter B, Klaus P, et al.IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder[J] .Journal of AOAC International,1999, 82(4)∶923-928.

[9]董進法.轉基因生物多重熒光PCR檢測體系的建立[D].福建：福建農林大學，2007.

[10]劉光明，李慶閣，王群力，等.多重熒光 PCR同時檢測轉基因成分 35S和Nos 方法的建立[J].廈門大學學報，2002，21（4）：379-383.

[11]付偉，任嬌，魏霜，等.轉基因大豆 DAS44406-6多重熒光定量 PCR 檢測方法的建立[J].食品工業科技，2017（4）：63-66.

[12]Swan D C, Tucker R A, Holloway B P, et al . A sensitive,type- specific , fluorescence genic probe assay for detection of human papillomavirus DNA[J]. Clin Microbiol, 1997, 35( 4) ∶886-891.