TBX1基因可能通過調控Tgfb2基因的表達參與心臟發育及先天性心臟病的發生

程菲， 姜紅堃

先天性心臟病是最常見的出生缺陷，為嬰幼兒非感染性死亡的首要原因，占主要先天發育畸形的1/3[1]。心臟的形成過程十分復雜，由遺傳和環境因素共同作用引起，遺傳率達55%～65%。胚胎心臟發育過程中的任何紊亂均可導致先天性心臟病的發生。人類TBX1基因定位于22q11.21，為染色體22q11.2微缺失中關鍵基因[2-3]，參與心臟、耳、甲狀腺,尤其是肺動脈干基部心肌的發育[2，4]。該基因主要表達于第二心區，且以劑量依賴效應的方式調節心臟流出道的發育，單倍劑量不足是引起22q11.2微缺失綜合征患者心臟發育缺陷的重要原因[3]。轉化生長因子β2基因(transforming growth factor beta 2，Tgfb2)是高度保守的TGFp超家族成員之一，具多種生物學作用。RXRA基因敲除小鼠中Tgfb2基因表達升高，心肌細胞凋亡增加，從而導致胚胎心臟流出道發育異常，推測Tgfb2基因可能是圓錐動脈干畸形的致病易感基因[5]。課題組前期研究發現，大鼠胚胎心肌細胞系TBX1基因干擾后，差異表達芯片預測結果提示Tgfb2基因表達增高。為進一步明確二者之間的關系，本研究擬將TBX1-siRNA轉染至大鼠胚胎心肌細胞系H9C2中，檢測干擾后Tgfb2基因mRNA的表達水平，以期探討二者之間的關系及在心臟發育及先天性心臟病發病中的作用。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及材料 大鼠胚胎心肌細胞H9C2購自中國科學院細胞庫；胎牛血清和DMEM購自Gibco；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自大連保生物有限責任公司；SYBR Green PCR Master mix購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細胞培養與分組 大鼠胚胎心肌細胞系H9C2常規在DMEM高糖培養基(10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養。0.25%的胰酶(磷酸鹽緩沖液配制)消化傳代。根據處理因素不同，將細胞分為NC-siRNA組和TBX1-siRNA組。siRNA的設計與合成Negative Control、TBX1-siRNA由上海艾博思生物技術公司設計與合成。NC-siRNA：上游引物5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,下游引物5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；TBX1-siRNA：上游引物5′-CCG ACU AUA UGC UGC UCA UTT-3′，下游引物5′-AUG AGC AGC AUA UAG UCG GTT-3′。

1.3 轉染細胞 常規培養的H9C2細胞，轉染前一天調整細胞濃度為5×104個/mL，以每孔2 mL接種于6孔板中培養24 h，加入轉染混合液前，用磷酸鹽緩沖液清洗。采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000進行轉染。首先在兩個無菌Eppendorf管中，加入250 μL無抗生素、無血清RPMI 1640培養基，然后分別加入5 μL轉染劑和5 μL siRNA，混勻，室溫放置5 min，再將兩管內容物混合，室溫放置20 min。將混合物加至接種細胞的孔中，均勻分散。每孔加入1 500 μL無抗生素DMEM高糖培養基，混合均勻，繼續培養6～8 h后，磷酸鹽緩沖液清洗，換含血清、無抗生素的DMEM高糖培養基。轉染24 h后換正常DMEM高糖培養基繼續培養。轉染48 h后檢測干擾效率。

1.4 細胞總RNA提取 將細胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入TRIzol試劑1 mL；室溫靜置5 min，用加樣器吹打，收集在1.5 mL Eppendorf管內；加氯仿0.2 mL，渦旋振蕩15 s，室溫放置2～3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將無色上清移入另一新管；加入異丙醇0.5 mL混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀；4 ℃、12 000 r/min離心10 min棄上清；加75%乙醇(焦碳酸二乙酯水配制)1 mL，渦旋漂洗1次；4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清；空氣干燥15 min,沉淀溶于0.01%焦碳酸二乙酯水，取少量用于濃度及純度測定，其余分裝后置-70 ℃保存；測定RNA濃度。

1.5 cDNA合成 用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA第1鏈，反應總體積為20 μL，反應條件為：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.6 實時定量PCR法(qRT-PCR)檢測心肌組織TBX1及Tgfb2的mRNA表達

1.6.1 引物設計與合成 應用Primer 5.0軟件設計引物，所用引物序列見表1。

表1 引物序列

引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.6.2 qRT-PCR SYBR Green PCR Master mix(美國Applied Biosystems公司)染料法行TBX1基因及Tgfb2基因qRT-PCR擴增。反應體系如下：cDNA 0．5 μL；2×SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL；引物(上下游引物的終濃度各為900 nmol/L) 1.0 μL；ddH2O 11.0 μL。反應條件：50 ℃ 2 min→95 ℃ 10 min→(92 ℃ 15 s→56.5 ℃ 1 min)×40個循環。以GAPDH為內參，校正每個樣本的Ct，采用thermal cycler軟件包計算△Ct值，以2-△△Ct計算基因表達。實時熒光定量PCR儀(7500型)由美國Applied Biosystems公司提供。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測心肌細胞TBX1 mRNA的表達 H9C2細胞轉染TBX1-siRNA 48 h后為(0.22±0.02)，與NC-siRNA(0.99±0.02)比較，TBX1 mRNA表達顯著下調，差異有統計學意義(t=46.000，P<0.05)。

2.2 qRT-PCR檢測心肌細胞Tgfb2 mRNA的表達 H9C2細胞轉染TBX1-siRNA 48 h后為(2.19±0.01)，與NC-siRNA(1.00±0.01)比較，Tgfb2 mRNA表達明顯上調，差異有統計學意義(t=-145.745，P<0.05)。

3 討論

心臟是胚胎發育過程中最早形成的器官，其發育涉及多個基因的先后表達及細胞的分化、遷移、轉化、增殖等過程。基因的精確調控是心臟正常形成的保障，其間的遺傳或環境因素引起的任何紊亂均可導致先天性心臟病的發生。先天性心臟病可因心臟結構及血流動力學異常而導致身體運動耐力下降、腦發育延遲、肺動脈高壓、心臟擴大、心功能衰竭、艾森曼格綜合征、血栓栓塞、亞急性細菌性心內膜炎、心律失常，甚至死亡[2-4]。

TBX1基因是Tbox轉錄因子家族成員，前期研究發現TBX1基因主要表達在內胚層的咽弓組織，調控心臟神經嵴細胞的正常遷移，促進第二生心區細胞的增殖，對主、肺動脈隔發育有調節作用[6]，這表明在心臟流出道發生過程中TBX1基因起到了關鍵作用。TBX1基因功能出現異常、表達過高、表達過低均可導致心臟圓錐動脈干畸形。已在先天性心臟病患兒有研究顯示TBX1基因核苷酸發生變異、基因單拷貝出現重復、缺失都可引起心臟圓錐動脈干畸形[7-8]。目前人們對TBX1基因的研究限于TBX1基因編碼區的核苷酸變異[9]或基因缺失、重復等方面[10]，對TBX1基因表達調控異常的研究則很少。為進一步尋找TBX1基因的下游基因，課題組前期研究將TBX1-siRNA轉染至大鼠胚胎心肌細胞系H9C2中，采用SurePrint G3 Rat GE 8*60KMicroarray檢測分析技術篩選出表達上調基因755個，表達下調基因240個。根據分析結果，結合心臟發育相關基因文獻，選取表達變化明顯的Tgfb2基因，對其進行深入研究。設計此基因的引物，收集轉染TBX1 siRNA后48 h的H9C2細胞系，進行RNA提取，qRT-PCR檢測干擾后觀察此基因的表達水平。本研究擬通過檢測TBX1基因干擾后Tgfb2基因表達變化探討TBX1基因參與心臟發育及先天性心臟病發生的可能途徑。

Tgfb2主要表達在心臟的心內膜墊組織，可促進房室管和流出道的內皮細胞轉化成心內膜墊細胞，抗Tgfb2抗體可以有效地抑制內皮細胞的轉化[11]。有趣的是Tgfb2表達在整個胚胎心臟發育過程中均可檢測到，而在成人心臟中幾乎檢測不到[12]。目前也有研究認為Tgfb2不僅參與心臟內皮間充質的轉化，也是誘導神經嵴細胞由心臟流出道遷移的趨化因子[13-14]。該基因敲除小鼠可出現右室雙流出道、房室管畸形等多種圓錐動脈干畸形[5]。研究表明，異位RA信號抑制Tgfb2信號通路在心肌早期表達，這是建立正常心室大動脈連接的關鍵形態之一[15]。

心臟從開始發育到最終成熟、成熟后的功能維護，是一個整體、動態、極其復雜且精細的調控過程。多種轉錄因子參與其關鍵過程，但具體機制如上游調控信號通路及下游靶基因則知之甚少。本研究采用實時定量PCR法檢測TBX1干擾效率后Tgfb2基因mRNA的表達水平，結果發現Tgfb2基因表達增高，與差異表達芯片預測結果相符。推測TBX1基因可能通過調控Tgfb2基因的表達參與心臟發育及先天性心臟病發生。對TBX1基因及Tgfb2基因的深入研究有望為產前診斷及遺傳干預提供理論依據及潛在的治療靶標。下一步課題組將深入探討TBX1基因調控Tgfb2基因表達的分子生物學途徑。

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