夏枯草轉錄組SSR位點信息分析

王會敏，蘇秀紅，2，董誠明，2，朱畇昊，2*

(1.河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，河南 鄭州 450046)

夏枯草為唇形科夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，味辛、苦，性寒，歸肝、膽經，具有清肝瀉火、明目、散結消腫的功能[1]。廣泛分布于全國各地，主產于江蘇、河南、浙江、安徽等地[2]。夏枯草既是臨床常用中藥材，又是藥食兩用之品，具有獨特的藥用和經濟價值。近年來我國夏枯草市場需求量呈增加態勢，使得夏枯草野生資源逐漸變得稀少。因此，急需加強對夏枯草種質資源的保護和利用。目前夏枯草研究主要集中在栽培、質量評價、臨床應用、化學成分研究及藥理作用等方面[3]，遺傳多樣性研究和分子標記研究有廖麗等[4]利用ISSR方法分析夏枯草種質間的遺傳多樣性；賴江琴等[5]對夏枯草不同品種間進行RAPD分析；江建銘、沈宇峰等利用AFLP方法對夏枯草進行種質資源遺傳多樣性分析[6-7]。目前尚缺乏對夏枯草進行可以大規模種質鑒定、分子標記輔助育種、功能基因定位等的具有種屬特異性的分子標記研究。

簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)又稱微衛星(microsatellite)，是一種由1～6個核苷酸組成的串聯重復單元，廣泛分布在真核和原核生物基因組中[8]。SSR標記是較為理想的遺傳標記，具有數量豐富、重復性好、多態性強、可靠性高和共顯性遺傳易于分析等特點，成為構建連鎖遺傳圖譜、研究群體遺傳學、進行分子標記輔助育種、分析系譜、繪制品種指紋圖譜等的理想工具[9]。常用的SSR標記主要有基因組SSR(genomic-SSR)和轉錄組SSR(EST-SSR)；轉錄組SSR避免了基因組SSR標記引物開發需要構建文庫所帶來的步驟繁瑣、工作量大、成本高及大量人力、物力和時間投入的缺點，同時轉錄組SSR多態性可能與基因功能直接相關，在不同物種間具有良好的通用性[10]。本研究基于夏枯草轉錄組文庫高通量測序結果，利用MicroSAtellite(MISA)軟件搜索夏枯草SSR位點信息，分析其分布、組成特征，并進行初步可用性評價，在此基礎上開發設計夏枯草轉錄組SSR引物，以期為夏枯草遺傳多樣性研究和分子標記輔助育種提供參考和基礎。

1 材料和方法

1.1 夏枯草轉錄組數據來源

轉錄組測序樣本采自于河南省確山縣夏枯草GAP種植基地，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為唇形科夏枯草PrunellavulgarisL.。夏枯草轉錄組數據來自于課題組前期利用Illumina HiSeq2500測序平臺對夏枯草莖、葉、果穗進行的轉錄組測序，測序結果使用Trinity軟件進行從頭組裝，得到共含32 336 280 bp核苷酸的Unigene(>1 kb)5450條。

1.2 方法

使用軟件MISA(Micro Satellite identification tool，http：//www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對夏枯草轉錄組中序列長度在1 kb以上的Unigenes進行SSR位點搜索，并利用軟件Primer3對搜索到的SSR位點設計引物。所檢測SSR位點包括單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復6類。設置參數為單核苷酸重復至少10次、二核苷酸重復至少6次；三核苷酸重復、四核苷酸重復至少5次；五核苷酸重復和六核苷酸重復至少4次。復合SSR兩個位點間最大間隔堿基數為100。將生成的文本文件導入到Excel(Microsoft Office Excel 2016)表中，對查找到的SSR位點信息進行特征分析。

2 結果與分析

2.1 夏枯草轉錄組中的SSR位點數量與分布頻率

利用軟件MISA搜索夏枯草轉錄組序列SSR位點，設置的SSR最小長度均不小于12 bp。從總長度約32.34 Mb的15 443條轉錄組Unigene序列(序列長度>1 kb)中搜索到5450個SSR位點，分布于4248條Unigene序列中，SSR發生頻率(含有SSR的Unigene數目與總Unigene的數目之比)為27.5%，出現頻率(檢出SSR個數與總Unigene數目之比)為35.29%。平均每相隔5.9 kp出現1個SSR位點，復合型SSR有267個，其中3329條Unigenes含有單個SSR，919條Unigenes含有2個或2個以上的SSR。

夏枯草轉錄組SSR重復類型較多，單核苷酸重復至六核苷酸重復都有出現，所占比例變化較大。從SSR位點數量上看，二核苷酸、三核苷酸及單核苷酸重復是其優勢重復類型，分別有2430、1550、1349個，合計占總SSR位點數量的97.78%。其中以二核苷酸重復比例最高，占44.59%；其次是三核苷酸重復和單核苷酸重復，分別為28.44%和24.75%。四、五、六核苷酸重復類型的數量較少，總計2.22%。見表1。

2.2 夏枯草轉錄組中SSR重復次數和基序長度特征

夏枯草轉錄組中的SSR位點的序列總長度達到32 336 280 bp。基序重復次數的變異引起位點長度的變異是產生SSR多態性的主要原因[8]。分析發現，夏枯草轉錄組中SSR重復單元的重復次數集中在5～11次，隨著重復次數的增加，SSR位點數量隨基序長度和重復次數的變化總體上呈現下降趨勢，其中以6次重復(1380個)最多，占總SSR的25.32%，其次為重復次數5、10、7、8、11次，SSR位點數分別為1150、895、743、427、304個，占總SSR的21.1%、16.42%、13.63%、7.8%、5.58%。統計5～11次重復的SSR位點共有5144個，占94.39%；12～24次重復的SSR位點共有306個，占5.61%，見表2。

表1 夏枯草轉錄組中SSR統計

在夏枯草轉錄組SSR中共發現160種重復基元，一到六核苷酸重復分別有4、12、60、59、20、5種，從分布頻率上看，在5450個SSR位點中出現頻率最多的基元是AG/CT(1362個，約占25%)，其次是A/T(1322個，占24.26%)。二核苷酸重復中AG/CT占絕對優勢，其次是AT/AT(640個，占11.74%)和AC/GT(425個，占7.8%)。三核苷酸重復中AAG/CTT出現頻率最高(394個，占7.23%)，其次是AGC/GCT(240個，占4.4%)和CCG/CGG(207個，占3.8%)。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸中各類重復基元出現頻率相對較低，均在0.3%以下。在夏枯草轉錄組SSR中，還發現3個CG/CG的二核苷酸重復基元。見表3和圖1。

表2 夏枯草轉錄組SSR重復次數分布圖

注：“-”表示SSR數量為0。

表3 夏枯草轉錄組中不同微衛星重復基元(motif)出現的頻率

注：其他重復類型為出現頻率在0.3%以下的重復類型。圖1 夏枯草轉錄組SSR中不同重復基元類型及不同重復基元的分布

2.3 夏枯草轉錄組SSR可用性評價

SSR分子標記在個體中是否具有多態性以及多態性的高低是判斷其可用性的重要依據，SSR片段長度是影響其多態性高低的重要因素[11]，為了提高潛在的多態性差異，增加分析結果的實用性，本研究中只搜索長度在12 bp以上的SSR。結果表明，夏枯草轉錄組中所發現的5450個SSR中，微衛星長度存在顯著變異。夏枯草轉錄組SSR大部分基序長度集中在12～20 bp，共有3199個，占75.97%；其次是21～30 bp，共有467個，占11.1%；30 bp以上的基序數量相對較少，共有545個，占12.94%。根據Temnykh等[12]提出的當SSR長度大于或等于20 bp時多態性較高，長度在12～20 bp的SSR多態性中等，而長度在12 bp以下時多態性極低，研究結果表明夏枯草轉錄組SSR具有較高的多態性。

2.4 夏枯草轉錄組SSR引物設計

夏枯草轉錄組SSR出現的頻率較高，重復單元的類型較為豐富。從夏枯草轉錄組15 443條序列長度在1 kb以上的Unigenes進行SSR位點搜索，共獲得5450個SSR位點，這些SSR位點分布在4248條序列上，平均分布距離為5.93 kb，出現頻率35.29%。為進一步將篩選出的夏枯草轉錄組SSR位點應用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等分子育種相關的研究，我們對找出的SSR位點采用Primer 3軟件進行引物設計，每個SSR位點設計3對引物，共得到4228對SSR位點特異性引物。部分引物序列信息見表4。

3 討論

本研究通過對夏枯草莖、葉、果穗3個樣本高通量測序組裝后序列長度在1 kb以上的Unigene進行SSR位點分布及序列特征分析，結果發現，從15 443條Unigenes中找到5450個SSR位點，分布在4248條Unigenes中，平均距離為5.59 kb，跟其他檢索一至六核苷酸重復基元SSR的藥用植物相比，夏枯草轉錄組SSR的出現頻率明顯高于茯苓(1/17.01 kb)[13]、魚腥草(1/9.04 kb)[14]、膜莢黃芪(1/7.97 kb)[15]、連翹(1/7.9 kb)[16]、番紅花(1/5.67 kb)[17]；低于枇杷(1/5.52 kb)[18]、冬凌草(1/3.52 kb)[19]、藍靛果忍冬(1/2.58 kb)[20]、杜仲(1/0.73 kb)[21]：這表明夏枯草轉錄組中SSR數量比較豐富。除此之外，在夏枯草轉錄組序列長度在1 kb以上的15 443條Unigenes中找到5450個SSR位點，其出現頻率為35.29%，普遍較其他物種高，造成這種差異的原因，一方面可能與物種的特異性有關，還與搜索標準設定、軟件類型、原始序列數據、長度不同有關[22]。

SSR位點多態性主要是因基元重復數和堿基數不同而形成的序列長度多態性[8]。夏枯草轉錄組SSR中，單核苷酸重復基元出現的重復次數類型相對較多且跨度大，如C/G有27種，跨度有10～24次；二核苷酸重復AG/CT有425種，6～17次。Xu等[23]認為重復序列長度存在一個閾值，在20～30 bp，長度在閾值以下的SSR傾向于擴張，序列長度在閾值以上的SSR傾向于收縮。夏枯草轉錄組中12～20 bp的SSR位點占75.97%，因而這些位點傾向于擴張；長度在30 bp以上的SSR位點約占12.94%，這些位點傾向于收縮。根據上述觀點，夏枯草轉錄組測序發掘的5450個SSR位點大部分具有多態性潛能，能夠應用于分子標記研究。此外，在夏枯草轉錄組中，基序長度在20 bp以上的SSR位點達到1012條，占SSR總數的18.57%，并且其中有93.09%是多態性潛能較高的低級基元一、二、三核苷酸重復序列，這部分的SSR可以作為潛在的SSR重復基元加以開發利用。

表4 夏枯草EST-SSR部分引物序列

夏枯草轉錄組中SSR種類豐富，一至六核苷酸重復類型都有出現，二核苷酸、三核苷酸和單核苷酸重復是其優勢重復類型，分別有2430、1550和1349個，占夏枯草轉錄組SSR總數的44.59%、28.44%、24.75%，這與魚腥草[14]、連翹[16]情況相似，與多數報道的以二、三核苷酸重復為主稍有不同，出現這種情況可能與物種主導重復類型差別有關；四、五、六核苷酸重復類型的數量較少，共計2.22%。在夏枯草轉錄組SSR中，AG/CT(1362個，占25.00%)出現的頻率最高，這與煙草、茶樹、馬尾松、杏樹、魚腥草[14]、半夏[8]、胡桃[24]、番紅花[17]、丹參[25]、浮萍[26]情況一樣，其次是A/T(1322個，占24.26%)；在二核苷酸重復中，除AG/CT外，AT/AT(640個，占11.74%)出現頻率最多，這與半夏[8]、杜仲[21]出現情況類似；在夏枯草轉錄組SSR中，三核苷酸重復種類繁多，其中以AAG/CTT(394，占25.42%)為主導，這與半夏[8]、杜仲[21]、番紅花[17]情況相類似。這種分布差異可能與物種的組成結構有關，但也有可能與物種轉錄組SSR來源、SSR數目、密碼子偏倚、編碼相應蛋白質的使用頻率較高有關[22]。GC含量是堿基序列的重要特征之一，其反映基因的結構、功能和進化信息，GC分布不均會導致基因不同，GC含量序列不同其性質和功能也有差異；在多個研究中均提到GC重復基元可能與脅迫抗性、轉錄調控、信號傳導等特定功能相關[27]。GC在大多數植物中很難見到或者出現頻率較低[11，15]，本文中也僅發現3個，出現頻率也很低，存在一定的偏倚。

綜上所述，在夏枯草轉錄組序列中存在豐富的SSR，且出現頻率高、密度大、類型多樣。同時參照前人研究結果對其多態性潛能進行了評價，發現具有較高的可用性。由于SSR引物在品種間具有較高的通用性，本研究結果為進一步開發夏枯草SSR分子標記奠定了基礎，有助于夏枯草功能基因資源、種質資源評價、遺傳多樣性研究等方面的研究。

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