HPLC同時測定牛大力中刺桐堿和高麗槐素的含量△

陳明權，彭富全，何風雷，農根林

(廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東 廣州 510288)

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]，俗稱山蓮藕、血藤、九龍串珠、牛古大力、大力薯。牛大力性平味甘，具補虛潤肺、強筋活絡之功效，臨床證明其對腰肌勞損、風濕性關節炎等有一定療效[2]。牛大力為嶺南地區藥食兩用植物，是舒筋健腰丸、壯腰健腎丸等名優產品的重要原料之一。現代研究表明，牛大力藥材中主要含有刺桐堿、高麗槐素和芒柄花素等化學成分[3-5]；其中刺桐堿具有增強細胞毒性、抗焦慮、抗痙攣和DPPH自由基清除作用[6]，高麗槐素具有抗補體作用，對白血病細胞(HL-60)和大鼠嗜堿性細胞白血病細胞(RBL-2H3)具有細胞毒活性[7-8]。

陳勇等[9]以芒柄花素和高麗槐素為指標成分，建立了測定牛大力藥材中芒柄花素和高麗槐素含量的方法；但結果表明，8個批次的牛大力中芒柄花素的含量均較低(≤0.002%)；因此，該成分作為質量控制指標的實際意義不大。本文首次以刺桐堿和高麗槐素作為指標性成分，建立了牛大力藥材中刺桐堿和高麗槐素含量的測定方法，為牛大力藥材的質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜議(美國安捷倫公司)；Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司)；Millpore simplicity-67120型超純水器(美國密理博公司)；BS110S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；WXJ型粉碎機(上海凱旋中藥機械制造有限公司)；KQ-100DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

牛大力藥材分別采集或購自廣東電白(S1～S2)、云南勐海(S3～S4)、廣州清平中藥材市場(S5～S6)，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為豆科植物美麗崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的根。對照品刺桐堿(成都普菲德生物技術有限公司，供含量測定用，批號：140428，純度：98%)；高麗懷素(成都普菲德生物技術有限公司，供含量測定用，批號：131025，純度：98%)；乙腈(Fisher，色譜純)；冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；液相用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，按程序梯度洗脫(0～12 min，10%乙腈；12～13 min，10%～40%乙腈；13～35 min，40%乙腈)，檢測波長為280 nm(0～13 min)和310 nm(13～35 min)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。在該條件下，混合對照品及牛大力樣品的色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.牛大力樣品；1.刺桐堿；2.高麗槐素。圖1 混合對照品和牛大力樣品HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取牛大力樣品粉末1.00 g(過45目篩)，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱定重量，超聲提取40 min，放冷至室溫，補重，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品刺桐堿7.11 mg、高麗槐素2.17 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為142.2、43.4 μg·mL-1的混合對照品溶液，4 ℃保存備用。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取上述混合對照品溶液2、4、6、8、10 μL，按2.1項色譜條件進樣分析，以各成分峰面積Y為縱坐標，以進樣量X(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，并求出刺桐堿和高麗槐素的回歸方程分別為Y=1 231.5X-8.68(r=0.999 9)和Y=1 309.3X-7.24(r=0.999 8)。結果表明，刺桐堿和高麗槐素的進樣量分別在0.284 4～1.422 0 μg和0.087 0～0.435 2 μg與峰面積值呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，測得峰面積積分值，計算相對標準偏差，結果刺桐堿的RSD=0.89%，高麗槐素的RSD=1.73%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液，分別在0、3、6、12、24、48 h按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得刺桐堿的RSD=1.37%，高麗槐素的RSD=1.52%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一供試樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行HPLC分析。測得峰面積積分值，計算相對標準偏差，結果刺桐堿的RSD=1.42%，高麗槐素的RSD=1.91%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已測定的牛大力藥材(編號：S1)粉末1.0 g，共6份，分別精密加入刺桐堿對照品溶液(質量濃度為2.04 mg·mL-1)和高麗槐素對照品溶液(質量濃度為0.13mg·mL-1)各1 mL，按供試品溶液制備方法制備，進樣10 μL，注入HPLC色譜儀，測其峰面積，計算回收率。刺桐堿平均回收率為99.6%，RSD=1.57%(n=6)，高麗槐素平均回收率為100.9%，RSD=2.18%(n=6)。結果見表1、表2。

表1 牛大力中刺桐堿加樣回收率試驗結果

表2 牛大力中高麗槐素加樣回收率試驗結果

2.9 樣品的測定

取6批牛大力樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定含量，結果見表3。

表3 牛大力樣品中刺桐堿、高麗槐素含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 HPLC色譜條件的優化

3.1.1 流動相組成系統的優化 考察了甲醇-水、乙腈-水及在流動相中添加不同濃度的冰醋酸對樣品分離的影響，結果表明采用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液對刺桐堿、高麗槐素成分的分離有明顯改善；采用梯度洗脫較等度洗脫能明顯改善各特征峰的分離效果，既能滿足基線分離的要求，又有適宜的保留時間；故實驗選用乙腈-0.1%冰醋酸水溶液作為流動相并采用梯度洗脫方式。

3.1.2 檢測波長的選擇 HPLC-PDA 分析結果表明，2個指標成分刺桐堿、高麗槐素最大吸收波長分別為280、310 nm。因此，選擇280、310 nm分別作為刺桐堿、高麗槐素的檢測波長，在兩個波長下，表觀峰度高、峰形較好且基線穩定。

3.2 藥材提取方法的優化

采用正交試驗法考察了超聲提取時間(40、60、80 min)、提取溶劑(50%、70%、90%乙醇水)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)對牛大力藥材中刺桐堿、高麗槐素成分的提取效率，結果表明，刺桐堿的最佳提取工藝為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶10)，其中料液比“1∶10”與“1∶20”對刺桐堿含量的影響不存在顯著差異。高麗槐素的最佳提取工藝為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)，其中料液比“1∶10”與“1∶20”對高麗槐素含量的影響存在顯著差異。綜合考慮，牛大力最佳提取工藝選擇為超聲提取40 min、50%乙醇、料液比(1∶20)。

3.3 小結

測定了不同來源的6個批次的牛大力藥材中刺桐堿和高麗槐素的含量，其藥材的HPLC色譜圖基本一致，但藥材中刺桐堿和高麗槐素含量具有一定差異性。本文建立了以刺桐堿、高麗槐素為指標成分的牛大力藥材的含量測定方法，方法簡便、準確、穩定性好，為牛大力藥材質量控制提供了新的參考。

[1] 廣東中藥志編輯委員會.廣東中藥志：第一卷[M].廣州：廣東科學技術出版社，1994：168.

[2] 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編：上冊[M].3版.北京：人民衛生出版社，1986：200.

[3] 張宏武，丁剛，李榕濤，等.牛大力中刺桐堿的分離鑒定和含量測定[J].藥物分析雜志，2011，31(6)：1024-1026.

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[5] 王春華，王英，王國才，等.牛大力的化學成分研究[J].中草藥，2008，39(7)：972-975.

[6] 唐崢嶸，王利勤，葉廣達.刺桐屬植物的生物堿成分及其藥理作用研究進展[J].廣州化工，2012，40(2)：43-46.

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[8] Uchiyama T，Furukawa M，Isobe S，et al.New oleanane-type triterpene saponins from Millettia speciosa[J].Heterocyeles，2003，60(3)：655-661.

[9] 陳勇，謝臻，巫繁菁，等.HPLC測定廣西牛大力藥材中芒柄花素和高麗槐素的含量[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2013，15(2)：260-263.