HPLC測定朝鮮白頭翁中常春藤皂苷C的含量

任喬森，王海洋，翟宏宇，趙琳琳，李秀芬，唐秋竹

(吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長春 130033)

朝鮮白頭翁為毛茛科植物Pulsatillacernua(Thanb.)Bercht et Opiz.的干燥根[1]，分布于中國遼寧南部、吉林東部，在朝鮮、日本、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布，生于山坡草地、灌叢間。其性寒，味苦，歸肝、胃經(jīng)。具瀉火解毒、止痛、利尿消腫、涼血等功效[2]。朝鮮白頭翁是朝鮮族民間用藥，其用藥歷史可追溯到14世紀(jì)，主治風(fēng)火牙痛、四肢關(guān)節(jié)疼痛、禿瘡、浮腫、細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、發(fā)熱、腹痛、下痢膿血、里急后重等證；現(xiàn)代藥理研究表明，朝鮮白頭翁還具有抑菌抗炎、抗微生物、抗生物酶、抗腫瘤等作用[3-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，朝鮮白頭翁中含有豐富的皂苷類成分，三萜皂苷是其主要的活性物質(zhì)，現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道多集中在白頭翁屬植物中總皂苷的含量測定[7-9]，而對(duì)某一單一成分的含量測定報(bào)道較少。本文采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地朝鮮白頭翁中專屬性成分——常春藤皂苷C進(jìn)行含量測定，并分析其分布特點(diǎn)，為朝鮮白頭翁的臨床療效和質(zhì)量控制提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)；BT-125D型分析天平(德國Sartorius)；DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；6202高速粉碎機(jī)(北京銀捷玉誠機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與材料

常春藤皂苷C對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：Must-16032507，純度：98.53%)；甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

實(shí)驗(yàn)中所用的18批朝鮮白頭翁藥材均由樸明杰采集自吉林省各地，由吉林省藥品檢驗(yàn)所溫立義副主任中藥師鑒定為朝鮮白頭翁Pulsatillacernua(Thanb.)Bercht et Opiz.的干燥根，烘干，備用。朝鮮白頭翁藥材樣本的采集信息見表1。

表1 采集的朝鮮白頭翁藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1200高效液相色譜儀；Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(28∶72)；流速：0.8 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測波長：201 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取常春藤皂苷C對(duì)照品適量，加50%乙醇水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取適量朝鮮白頭翁藥材，粉碎，過3號(hào)篩，精密稱定，稱取1 g于具塞錐形瓶中，向其加入50%乙醇水溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加50%乙醇水定容至刻度，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 空白對(duì)照試驗(yàn) 取50%乙醇水作為空白對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定分析，結(jié)果顯示，空白對(duì)照溶液在與常春藤皂苷C對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間處無色譜峰，表明溶劑對(duì)測定沒有干擾(見圖1、2)。

圖1 溶劑(50%乙醇)色譜圖

圖2 常春藤皂苷C對(duì)照品色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20 μL注入色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以常春藤皂苷C的含量(μg)和相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程Y=364.534 1X-1.326 2，r=0.999 9，結(jié)果表明常春藤皂苷C在0.220～2.203 μg線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(S4)，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品色譜峰峰面積的RSD=0.48%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下的供試品溶液(S4)，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、6、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示常春藤皂苷C色譜峰峰面積的RSD=0.11%，表明供試品溶液中常春藤皂苷C在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下的供試品溶液(S4)6份，分別照2.1項(xiàng)下方法測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示常春藤皂苷C峰面積的RSD=1.44%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取樣品(S4)1 g，共6份，分別加入常春藤皂苷C對(duì)照品適量，按2.2項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算常春藤皂苷C的回收率。結(jié)果見表2。

表2 朝鮮白頭翁中常春藤皂苷C回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

注：常春藤皂苷C對(duì)照品加入量均為19.036 0 mg。

2.4.7 耐用性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中選取了不同廠家色譜柱(Thermo Hypersil BDS C18、Phenomenex Gemini C18、Venusil XDP C18)及不同廠家和型號(hào)的高效液相色譜儀(Agilent 1290、島津LC-20A、Waters E2695)測定各供試品，結(jié)果顯示不同廠家色譜柱和不同儀器均能對(duì)樣品進(jìn)行較好分離，適用性良好。

2.5 樣品測定

分別取不同產(chǎn)地的18批朝鮮白頭翁藥材，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算含量，結(jié)果見表3、圖3。

表3 朝鮮白頭翁樣品中常春藤皂苷C含量測定結(jié)果(n=3)

圖3 朝鮮白頭翁供試品色譜圖

由表3可以看出，18批朝鮮白頭翁中常春藤皂苷C含量測定結(jié)果為0.806%～4.317%，差異較大，其中，采集于延吉市依蘭鎮(zhèn)臺(tái)巖村的朝鮮白頭翁(S3)中常春藤皂苷C含量最高，為4.317%；而采集于通化縣東來鄉(xiāng)的樣品(S15)中常春藤皂苷C含量最低，僅為0.806%。

3 討論

3.1 提取時(shí)間的考察

實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，分別選取30、60、120 min進(jìn)行回流提取，結(jié)果顯示，提取30 min和提取120 min所得色譜峰的峰面積均低于提取60 min的峰面積，因此實(shí)驗(yàn)選取提取60 min為最佳提取時(shí)間。

3.2 流動(dòng)相的選擇

《中華人民共和國藥典》白頭翁含量測定項(xiàng)下提取三萜皂苷類成分的溶劑和流動(dòng)相均采用了甲醇[10]，而甲醇在201 nm有末端吸收，必然會(huì)對(duì)特征圖譜的色譜行為有干擾。經(jīng)試驗(yàn)，將白頭翁含量測定項(xiàng)選用的“甲醇-水”更改為“乙腈-水”，得到的色譜峰信息最多，且各成分分離情況相對(duì)較好，故最終選定乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

3.3 常春藤皂苷C的含量差異

18批朝鮮白頭翁樣品中常春藤皂苷C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.806%～4.317%，結(jié)果顯示，采集于延邊地區(qū)的含量要明顯高于其他地區(qū)，而采集于通化市、白山市、集安市等地的常春藤皂苷C含量較低，提示延吉地區(qū)為用藥的優(yōu)選區(qū)域。但朝鮮白頭翁系多年生草本植物，影響含量的因素較多，除生長地域外，生長環(huán)境、生長年限、采收時(shí)間以及藥材的凈制程度等也都是影響含量高低的因素。

3.4小結(jié)

本文采用HPLC研究了朝鮮白頭翁中常春藤皂苷的含量，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本方法專屬性和重現(xiàn)性強(qiáng)、回收率好，可用于評(píng)價(jià)朝鮮白頭翁的質(zhì)量。

常春藤皂苷C為朝鮮白頭翁中三萜皂苷的主要類型，含量較高，已證實(shí)其具有抑菌抗炎、清熱解毒等生物活性，可作為朝鮮白頭翁含量測定的主要指標(biāo)及質(zhì)量控制依據(jù)。

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