脹果甘草渣及其黃酮制品中3種成分的含量測定△

張娟，馮春艷，卿德剛，孫宇，倪慧*，賈曉光

(1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

甘草渣為甘草提取浸膏后的藥渣，富含黃酮類物質，具有抗真菌、抗潰瘍、抗氧化、保肝及降血糖等多種生物活性[1-3]，可作為藥品、保健食品、化妝品的原料使用。目前已有相關專利和文獻報道了甘草渣或甘草渣總黃酮作為活性提取物應用的實例，但都未明確其主要指標性成分[4-6]。新疆是我國最大的甘草產地及甘草初加工產品產地，生產中產生大量甘草渣。為了更好地利用甘草渣資源，我們在脹果甘草渣化學成分較為系統的分離鑒定基礎上[7-11]，以HPLC分析脹果甘草渣及其黃酮制品中的主要化學成分，同時檢測其中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量，以期為脹果甘草渣的開發利用及其黃酮制品質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998PDA檢測器；JY92-2D超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Metter AE163電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料

乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，水(超純水)，其他試劑均為分析純。

α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E(自制，經UV、IR、NMR和MS鑒定結構，含量>98%)；對照品甘草苷(批號：111610-201106)、甘草次酸(批號：1063-050327)、甘草酸銨(批號：110731-201317)，購自中國食品藥品檢定研究院。

脹果甘草渣(新疆阿拉爾新農甘草產業有限責任公司，批號：2014061 1)是經水提取甘草酸殘留的渣，參考自有專利技術[12]以3批脹果甘草渣分別制備獲得3批脹果甘草渣黃酮制品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～34 min，15%→47%A，85%→53%B；34～36 min，47%A，53%B；36～60min，47%→60%A，53%→40%B)，檢測波長：280 nm(化學成分分析)、310 nm(甘草查爾酮A、甘草黃酮B)、254 nm(甘草次酸)，柱溫：30 ℃，洗脫流速：1.0 mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取甘草渣2.0 g，精密加甲醇30 mL，密塞，搖勻，稱定質量，超聲(200 W、50 Hz)1 h，冷卻，再稱定質量，補足減失質量，過濾，取續濾液，即得。

精密稱取甘草渣黃酮制品25 mg，甲醇超聲(200 W、50 Hz)溶解并定容至25 mL，過濾，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸適量，分別加甲醇溶解并定容至5 mL，即得。

2.4 標準曲線繪制

精密吸取質量濃度分別為0.055 27、0.110 54、0.138 17、0.165 81、0.221 08 mg·mL-1的甘草查爾酮A，質量濃度分別為0.018 91、0.037 82、0.075 64、0.113 46、0.151 28 mg·mL-1的甘草黃酮B，質量濃度分別為0.012 31、0.024 62、0.036 93、0.049 24、0.061 55 mg·mL-1的甘草次酸對照品溶液，依次進樣10 μL，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線。

3 結果

3.1 主要化學成分的分析

在上述色譜條件下，進行了波長選擇，結果280 nm下能夠更為全面地反映脹果甘草渣及其黃酮制品中的各個成分。通過與各對照品的比對，初步確認脹果甘草渣及其黃酮制品中含有α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E 10種黃酮成分(見圖1)，其中甘草查爾酮A的響應最高。

注：1.α，2′，4，4′-四羥基查爾酮；2.刺甘草查爾酮；3.芒柄花素；4.甘草黃酮；5.甘草黃酮C；6.甘草查爾酮C；7.甘草查爾酮A；8.甘草查爾酮D；9.甘草黃酮B；10.kanzonol E。圖1 脹果甘草渣化學成分分析色譜圖(280 nm)

在254 nm下發現脹果甘草渣中還含有三萜成分——甘草次酸。但是在3個波長下，《中華人民共和國藥典》[13]“甘草”項記載的甘草苷、甘草酸銨的響應都很低(見圖2)。本文選擇含量最高的甘草查爾酮A和分離度較好的甘草黃酮B、甘草次酸進行含量測定。

注：1.甘草苷；2.甘草酸銨；3.甘草次酸。圖2 脹果甘草渣中甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸色譜圖(254 nm)

3.2 含量檢測方法學驗證及結果

3.2.1 標準曲線 標準曲線結果見表1，甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸分別在0.552 7～2.210 9、0.189 1～1.513 1、0.123 1～0.615 4 μg內呈良好的線性關系。

表1 甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的回歸方程及線性范圍

3.2.2 精密度試驗 取同批脹果甘草渣(批號：20140611)，按2.2方法制備供試品溶液，連續測定5次。結果表明3種成分含量測定結果的RSD分別為2.33%、1.11%、1.70%。表明儀器在該色譜條件下的精密度良好。

3.2.3 重復性試驗 取同批脹果甘草渣(批號：20140611)，按2.2方法平行制備6份供試品溶液，分別測定，考察重復性。結果3種成分含量測定結果的RSD分別為2.34%、2.06%、3.19%，表明該方法重復性良好。

3.2.4 穩定性試驗 取同批甘草渣(批號：20140611)，按2.2方法制備供試品溶液，室溫密閉放置0、3、6、9、15、24 h分別測定，考察穩定性。結果3種成分含量測定結果的RSD分別為2.18%、1.99%、3.01%，表明這3種成分在24 h內穩定性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測知甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸含量的脹果甘草渣樣品6份，分別加入2.3項下對照品溶液1 mL，按2.2方法制備供試品溶液并測定，計算各組分加樣回收率。結果甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的平均回收率分別為101.4%、98.4%、103.1%，RSD分別為2.11%、1.29%、2.31%。

3.2.6 樣品測定 分別檢測3批甘草渣及以其為原料制備得到的黃酮制品[12]中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸含量，考察工藝富集效果，結果見表2、圖3。

表2 脹果甘草渣及其黃酮制品中3種成分的含量測定結果(n=3) %

注：1.甘草查爾酮A；2.甘草黃酮B。圖3 甘草渣及甘草渣黃酮制品中甘草查爾酮A、甘草黃酮B色譜圖(310 nm)

注：1.甘草次酸。圖4 甘草渣及甘草渣黃酮制品中甘草次酸色譜圖(254 nm)

4 結論

本文參考課題組甘草渣黃酮成分分離鑒定研究結果[7-11]，完成了脹果甘草渣及其黃酮制品中10種黃酮成分和1種三萜成分的鑒定。甘草由水煮提甘草酸或甘草浸膏的過程中，甘草苷幾乎完全被提取，甘草渣中甘草酸的響應相比甘草也大大降低，即甘草中2種主要成分在渣中殘留已經很少。同時，我們也確認了脹果甘草渣及其黃酮制品是由甘草查爾酮A為主的查爾酮類成分構成，并含有另一種三萜成分——甘草次酸，這種化學成分組成上的較大變化也為甘草渣開發利用提供了新的可能性，課題組用本文所述黃酮制品研究了其對潰瘍性結腸炎的防治效果，結果其效果優于甘草苷為主要成分的水溶性黃酮，灌胃量為400 mg·kg-1時還優于陽性藥柳氮磺胺吡啶[14]，具有較大的深入開發價值。

對比3批脹果甘草渣及其對應黃酮制品中3種成分的含量，相比原甘草渣甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量分別提高了25倍、46倍、32倍以上，可見工藝達到了較好的富集目的[12]。但是，3種成分的含量因甘草渣原料波動而波動，這也意味著建立甘草渣及其黃酮制品質量控制方法的必要性。

本文建立了同時檢測脹果甘草渣及其黃酮制品中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量測定方法，方法學研究表明其準確可靠、可行性及重復性良好，可作為質量控制的定量方法。

[1] 劉芬，李寧，倪慧，等.甘草藥渣的研究進展[J].中國現代中藥，2011，13(2)：6-9.

[2] 賈國惠，賈世山.甘草中黃酮的藥理作用研究進展[J].中國藥學雜志，1998，33(9)：513-516.

[3] 田慶來，官月平，張波.甘草有效成分的藥理作用研究進展[J].天然產物研究與開發，2006，18(2)：343-347.

[4] 喬仲和，胡自如.甘草渣中大量黃酮類化合物的分離及甘草的綜合開發研究[J].中草藥，1997，28(9)：522-524.

[5] 羅峰，劉珍.甘草渣中總黃酮的提取工藝研究[J].塔里木大學學報，2006，18(2)：61-63.

[6] 李紅，李炳奇，劉紅，等.甘草渣中黃酮和多糖的提取及含量測定[J]，中華實用中西醫雜志，2006，19(21)：2595-2597.

[7] 李寧，劉芬，倪慧，等.新疆脹果甘草化學成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學學報，2011，28(5)：368-370.

[8] 劉芬，倪慧，卿德剛，等.甘草藥渣化學成分的分離與鑒定[J].中國藥物化學雜志，2011，21(4)：312-314.

[9] 張娟，劉芬，李寧，等.UPLC-TOF-MS鑒定脹果甘草藥渣中的黃酮類成分[J].現代藥物與臨床，2012，27(6)：593-596.

[10] 張娟，倪慧，卿德剛，等.HPLC法指認甘草廢渣中黃酮類成分及含量測定[J].中國中醫藥科技，2012，19(3)：233-234.

[11] 吳濤，卿德剛，倪慧，等.HPLC檢測甘草渣中黃酮含量[J].新疆中醫藥，2009，27(3)：42-43.

[12] 倪慧，張娟，卿德剛，等.從甘草廢渣中提取黃酮類物質的方法：201110129142.4[P].2013-01-30.

[13] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：86-87.

[14] 倪慧，賈曉光，曹麗，等.甘草黃酮類提取物用于制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用：201410305018.2[P].2017-10-24.