Box-Behnken響應面法優選七味雙花柴胡膠囊的水提工藝△

李東，宗梁，郝福，高雯，張綱，李志剛*

[1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.京津冀聯創藥物研究(北京)有限公司，北京 100083]

七味雙花柴胡膠囊，屬于國家六類中藥新藥，由金銀花、柴胡、連翹、黃芩、清半夏、西洋參、綿馬貫眾七味藥材組成，具有透邪解毒、清肺泄熱之功能，主要用于治療病毒性上呼吸道感染屬風熱證[1]。原湯劑臨床療效確切，但由于治療周期長，不便于患者用藥。原湯劑藥物性質多為水溶性成分，故為便于患者服用攜帶方便，保持原方劑療效，依據現代臨床應用和制劑技術，對其中5味藥材進行水提，經醇沉去雜干燥后的浸膏粉與剩余2味藥材的粉末及提取物粉混合制成膠囊劑。本實驗在單因素試驗的基礎上采用響應面設計[2](RSM)，以君藥金銀花綠原酸為指標，對七味雙花柴胡膠囊的提取工藝進行研究，為產品生產提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多)；電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 試藥

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201415)；乙腈(色譜純)；甲醇、乙醇、磷酸均為分析；純化水(自制，超純水)。

藥材均來自神威藥業集團有限公司，經公司質控部檢驗，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》[3]。

2 實驗方法

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水(13∶87)；檢測波長為327 nm；流速為1.0 mL·min-1，理論塔板數按綠原酸計算應不低于3000。

2.1.2 供試品溶液的制備 取七味雙花柴胡膠囊金銀花等五味藥材的提取液3 mL，精密量取，置20 mL錐形瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品，精密稱定，加50%甲醇制成質量濃度為42.15 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.4 線性關系考察 自動進樣對照品溶液4、6、8、10、12 μL，按色譜條件測定，以質量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，線性回歸方程為Y=49.994X-0.0602，r=0.999 7，結果表明，綠原酸在0.168 6～0.505 8 μg與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 方法學考察 專屬性試驗表明，陰性對照無干擾，供試品溶液24 h內穩定(RSD為0.66%)，精密度好(RSD為0.29%，n=6)，重復性好(RSD為0.86，n=6)，平均加樣回收率為100.96%(RSD為1.88%，n=6)。將供試品溶液和對照品溶液分別進樣10 μL，按外標法計算樣品中綠原酸含量。

注：A.七味雙花柴胡膠囊干膏樣品；B.七味雙花柴胡膠囊干膏陰性樣品；C.綠原酸對照品；D.空白；1.綠原酸。圖1 七味雙花柴胡膠囊提取液液相色譜圖

2.2 水提工藝單因素試驗

設定其他因素條件不變的情況下，依次平行進行試驗，分別考察提取次數、加水量、提取溫度、提取時間對綠原酸提取量的影響。

表1 水提工藝單因素試驗

2.3 水提工藝響應曲面試驗設計

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[4]，綜合單因素影響試驗，選取加水量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)作為考察對象，以綠原酸提取量為響應值，采用Design-Expert 8.0.6(試用版)實驗設計軟件的響應面分析法安排試驗，研究其對綠原酸提取量的影響。采用3因素3水平的響應面分析法進行試驗設計[5]，見表2。

表2 響應面分析因素水平及編碼

3 結果與分析

3.1 水提工藝單因素試驗結果與分析

3.1.1 提取次數對綠原酸提取率的影響 按2.2項下方法以綠原酸提取率分別考察提取次數對綠原酸提取情況的影響，結果見圖2(A)。結果表明，提取兩次已經基本提取完全，第三次以后綠原酸已經提取的較少，考慮到工業化成本且保證提取效果，故確定提取次數為兩次。

3.1.2 加水量對綠原酸提取率的影響 按2.2項下方法以綠原酸提取率分別考察加水量對綠原酸提取情況的影響，結果如圖2(B)。結果表明，隨著加水量的增加，綠原酸提取率不斷升高，(8倍量/8倍量)～(8倍量/8倍量)增加較(10倍量/8倍量)～(10倍量/10倍量)明顯，后續逐漸平緩，考慮到后續濃縮，故選擇以10倍量水作為中心點。

3.1.3 提取溫度對綠原酸提取率的影響 按2.2項下方法以綠原酸提取率分別考察提取溫度對綠原酸提取情況的影響，結果如圖2(C)。結果表明，提取溫度從80～100 ℃(煮沸)，綠原酸提取率在90 ℃出現峰值，故選90 ℃作為中心點。

3.1.4 提取時間對綠原酸提取率的影響 按2.2項下方法考察提取時間對綠原酸提取情況的影響，結果如圖2(D)。結果表明，隨著提取時間的增加，綠原酸提取率逐漸降低，考慮到工業化生產及其他因素的影響，選擇1 h作為中心點。

注：A.提取次數；B.加水量；C.提取溫度；D.提取時間。圖2 提取次數、加水量、提取溫度、提取時間對綠原酸提取率的影響

3.2 響應面試驗結果及分析

3.2.1 響應面試驗結果 對影響綠原酸提取量影響較大的加水量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)3因素作3水平的響應面試驗設計，所得結果見表3。

表3 響應面法試驗設計方案及結果

3.2.2 結果分析 通過Design-Expert 8.0.6(試用版)實驗設計分析軟件對表3的結果進行統計分析(見表4)，得到綠原酸提取量對提取溫度(A)、加水量(B)、提取時間(C)的二次多項回歸模型：綠原酸提取量=1.13-0.063×A+0.022×B-0.17×C-0.032×AB-1.025×10-3×AC-0.031×BC-0.12×A2-0.036×B2+5.433×10-3C2(r=0.989 1)。

由擬合回歸方程的相關系數可知，模型擬合程度良好，可以用此模型對七味雙花柴胡膠囊提取工藝進行分析和預測；由表4可知，所建立的二次多項式模型具有高度的顯著性(P<0.01)，模型的失擬項的P值為0.310 0，大于0.05，無顯著性差異，說明模型選擇合適，該模型的r=0.989 1，表明自變量與響應值之間線性關系顯著，回歸方程的各項方差分析影響因素從大到小排序為：提取時間>提取溫度>加水量。

各影響因素和響應值構成三維空間的曲面圖和二維平面圖上的等高線圖能直觀地反應出各因素的相互作用以及對綜合評分結果的影響，在三因素的范圍內，以綠原酸提取量最大值為目標，固定三因素之一，得到剩余兩因素與綠原酸提取量的響應三維圖和等高線圖，結果見圖3～4。

表4 方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05。

圖3 各因素交互作用對綠原酸提取量影響的3D響應面圖

圖4 各因素交互作用對綠原酸提取量影響的等高線圖

由圖3、圖4可知，提取溫度和加水量、加水量和提取時間對綠原酸提取量影響顯著，以綠原酸提取量為最大值，經過以上對回歸模型響應面的三維立體圖分析，最佳提取條件：提取溫度為86.41 ℃，加入11.75倍量水，提取時間為0.50 h。

3.3驗證試驗

按上述優化最佳提取條件平行進行3次驗證試驗，綠原酸提取量分別為13.18、13.20、13.12 g，平均值為13.17 g，RSD=0.32%，與理論實驗值的相對誤差為1.67%。說明驗證值與回歸方程預測值吻合較好，模型優化結果準確可靠。

4 結論與討論

結合單因素和Box-Behnken設計試驗，對影響七味雙花柴胡膠囊的提取工藝的4個因素(提取溫度、提取時間、加水量、提取次數)進行考察分析，采用Design-Expert 8.0.6(試用版)軟件對結果進行分析，得到綠原酸提取量的最佳提取條件：提取溫度86.41 ℃，加入11.75倍量水，提取0.50 h/次，提取2次。

樣品中綠原酸含量采用高效液相法進行測定。在供試品溶液配制中，對提取溶劑、提取溶劑用量、超聲時間等因素均進行了優選研究，確定了最佳配制方法。

七味雙花柴胡膠囊各味藥材主要含綠原酸、苷類、皂苷類、對羥基酚性成分[6-10]，多溶解于水，根據處方傳統用藥方式和各味藥的理化性質，更主要因為與其臨床上使用水煎提取保持一致，故采用水提取方式。

Box-Behnken試驗設計是可以評價指標和因素間的非線性關系的一種試驗設計方法，和中心復合設計不同的是其不需要連續進行多次試驗，并且在因素數相同的情況下，Box-Behnken試驗組合數比中心復合設計少，因而更經濟，同時也避免了傳統正交設計和均勻設計法的不足，兼顧了多個影響因素和評價指標，優選的工藝簡便合理、穩定，預測結果具有較高的準確性，為中藥提取工藝優化提供了依據。

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