二氧化鋯對大鼠牙周膜細胞分子生物學行為的影響*

黃玉喜 王莉莉 張振庭 李京榮 劉洪良 董海濤

全瓷冠如今已經逐漸發展成為了口腔固定修復的主要修復材料。在各類全瓷冠體系中，二氧化鋯全瓷冠的機械性能、美學性能均得到臨床的廣泛認可。相對于金屬烤瓷冠，特別是鎳鉻合金烤瓷冠、鈷鉻合金烤瓷冠的細胞毒性而言，全瓷冠的不良反應較少[1-3]。對于口腔修復材料的生物安全性，諸多學者都做了相關的研究，發現金屬烤瓷冠中的金屬成分對機體均存在某種形式的影響，無論何種金屬均如此，即使在全瓷冠中，金屬的含量也存在，但低于10%[4，5]。二氧化鋯屬于惰性陶瓷，不會引起細胞的轉化，無細胞毒性、無誘變、致畸、致癌等作用，已有實驗對二氧化鋯全瓷冠的細胞生物學行為進行了評價，認為其生物相容性良好且安全性較高[6]。但有研究者發現在37℃的人工唾液中檢測到有鋯離子、釔離子的釋放，甚至在酸性條件下，金屬離子成分釋放的更多[7]。此外，在二氧化鋯的加工制作過程中也難免會有雜質的滲入。因此，對于二氧化鋯的生物安全性有必要進行進一步的檢測。目前，主要的研究多集中在二氧化鋯全瓷冠的細胞生物相容性、細胞生物學行為方面，但二氧化鋯與牙周膜細胞之間相互作用的分子生物學行為的機制研究并不多。本文將二氧化鋯制作的浸提液作用于大鼠的牙周膜細胞，對其細胞活力、細胞凋亡、細胞周期、相關基因的表達影響如何等進行了評價，現報道如下。

1.材料和方法

1.1 主要試劑及材料 含10%胎牛血清的DMEM培養液；胰蛋白酶(Hyclone，美國)；PBS(Amresco，美國)；培養瓶、培養板(6孔、24孔、96孔)(Corning公司，美國)；CO2孵箱(Shellab,美國)；ZHJH-C1118C型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；CKX41型倒置相差顯微鏡；DT5-1低速離心機(北京時代北利離心機有限公司)；5y2002型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)；真空鑄造機(ARGONCASTER-SE，Shofu，Japan)；鎳鉻合金、鈀銀合金的相關材料(vita，美國)；二氧化鋯瓷塊(WIELAND公司，德國)；低速精密切割機(Isomet 4000，Buehler，美國)；酶聯免疫儀(Bio-Rad公司，美國)；CCK-8試劑盒(Cell ProliferationAaaay,Promega公司，美國)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(BU-Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit,Biouniquer公司，美國)；PCR擴增儀(2720，Applied biosystems，USA)； Real-time qPCR 儀 (7500Fast， Applied biosystems，USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠牙周膜細胞的培養及胚胎來源的鑒定 將SD大鼠的上下頜頜骨分離，取出其上下磨牙，漂洗10次。刮取磨牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎，采用胰酶消化法，將牙周膜碎屑平鋪于培養皿中置于CO2孵箱內(37℃，5%CO2，100%濕度)。當牙周膜細胞生長覆蓋達到培養皿底約60%時，進行首次傳代。對細胞進行胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態，當細胞回縮至圓形時，棄去胰酶，加入含l5%FBS的DMEM，反復吹打，制成細胞懸液，將此細胞懸液移入培養瓶中繼續培養。當細胞再次長滿瓶底時，對細胞進行傳代。第4代細胞用于細胞來源鑒定及后續的實驗。

1.2.2 實驗分組及各組試件的制作 實驗組(二氧化鋯試件組)；陽性對照組1(鎳鉻合金試件組)；陽性對照組2(鈀銀合金試件組)；陰性對照組(DMEM培養液組)。

于技工室按照烤瓷熔附金屬修復體的制作要求在真空加氬氣保護環境下對陽性對照組的合金材料進行熔鑄，獲得1cm×1cm×3mm的陽性對照組試件。利用低速精密切割機將二氧化鋯瓷塊在噴水冷卻條件下切割成1cm×1cm×3mm的實驗組試件。將所得的所有合金試件經碳化硅砂紙(P240-P1200)由粗到細進行拋光，后置于95%的乙醇溶液中超聲清洗20min，再去離子水漂洗10min，無油無水壓縮空氣吹干，經環氧乙烷滅菌后備用。

1.2.3 各組材料浸提液的制備 按照試件表面積與細胞培養液之比為0.5cm2/ml的標準，在6孔板中每孔加入6.4ml的DMEM培養液，置于CO2孵箱內(37℃、5%CO2、100%濕度的條件下)，浸提96h后備用。

1.2.4 細胞活性檢測——Cell Counting Kit-8取第四代大鼠牙周膜細胞，經胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度至5×104/ml，接種于96孔板中，每孔100μL。待細胞貼壁后，棄去原培養液，按各自的分組，將不同組的浸提液加入每孔中，每孔浸提液100μL，每組設5個復孔。將其置入CO2孵箱內預培養24h、48h、72h。終止實驗時，將孔板內注入10μL CCK-8溶液，孵箱內繼續培養2h后，30min內在酶標儀上讀取吸光光度值OD490nm。

細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組吸光度值均數/對照組吸光度值均數)×100%。

1.2.5 細胞凋亡檢測——Annexin V/PI雙染色法 取第四代大鼠牙周膜細胞，經胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度至5×105/ml，接種于96孔板中，每孔100μL。待細胞貼壁后，棄去原培養液，按各自的分組，將不同組的浸提液加入每孔中，每孔浸提液100μL，每組設5個復孔。將其置入CO2孵箱內預培養48h后，收集細胞，將細胞濃度調整為1×106/ml，以PBS離心2000rpm，5min，洗滌2次，收到約5×105個細胞。將處理所得細胞取出一部分，加入500μL的Annexin V Bingding Buffer懸浮細胞，再加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidiumlodide混勻、避光下，染色30min，在流式細胞儀以激發波長488nm、發射波長530nm檢測細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率。將處理所得的另一部分細胞70%冰乙醇固定后加入PI在室溫下進行避光染色，應用流式細胞儀測定細胞的不同細胞周期的比例。

1.2.6 凋亡相關分子表達量的檢測 取第四代大鼠的牙周膜細胞，按傳代的方法將其制成單細胞懸液，調整細胞濃度至4×105個/ml，接種于六孔板中，待細胞長滿約孔板底的80%左右時，以不含胎牛血清的DMEM培養液置換，血清饑餓24h，使細胞周期同步化。陰性對照組以新鮮培養液置換，其余各組分別用各組試件的浸提液置換并標記，置于CO2孵箱內培養48h。抽提RNA，依照相應試劑盒進行操作，反應得到cDNA，而后進行PCR的擴增，擴增的基因包括Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，根據擴增曲線計算mRNA的相對表達量(2-ΔΔCT值)。

1.3 統計分析 采用SPSS22.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差表示，各組間均數的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞形態的影響 大鼠牙周膜細胞在各組浸提液中培養48h后，DMEM培養液組中為正常牙周膜細胞形態，呈長梭形或多角星形；二氧化鋯組的細胞形態亦呈梭形或多角形，貼壁生長且輪廓清晰，核漿比例正常，胞質均勻；鈀銀合金組的細胞生長狀態亦良好，偶見脫落的懸浮細胞；鎳鉻合金組的細胞部分貼壁生長，有部分細胞呈圓形或不規則形態，胞膜增厚，胞質內出現空泡，還可見一些質膜崩解、核膜破裂的死亡細胞(見圖1)。

圖1 不同材料浸提液對大鼠牙周膜細胞培養48h的形態觀察

2.2不同時間點的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞活性的影響 應用CCK-8法檢測不同時間點的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞活性的影響，由表1可以看出，24h時二氧化鋯組、鈀銀合金組抑制率分別為1.40%和2.75%，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統計學差異(P＞0.05)，而鎳鉻合金組抑制率13.41%明顯高于其余各組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。48h時，DMEM組、二氧化鋯組、鈀銀合金組的OD值都略有增長，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統計學差異(P＞0.05)，但鎳鉻合金組OD值增長緩慢，高于其余各組，與其余各組相比均有統計學差異(P＜0.05)。隨著時間的增長，當72h時，二氧化鋯組、鈀銀合金組的OD值依舊在增長，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統計學差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組OD值基本無增長，而抑制率已經達到了22.42%，明顯高于其余各組(P＜0.05)。

表1 CCK-8法檢測不同時間點的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞活性的影響(n=5，xˉ±SD，%)

2.3 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測了各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞凋亡的影響。結果發現，各組材料浸提液作用于大鼠牙周膜細胞48h后，早期細胞凋亡率二氧化鋯組最低，為0.51%，鈀銀合金組次之，鎳鉻合金組最高，達到17.72%，二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組三者間兩兩比較均有統計學差異(P＜0.05)。晚期細胞凋亡率、總凋亡率也如此，二氧化鋯組、鈀銀合金組與鎳鉻合金組兩兩比較均有差異(P＜0.05)(見表2，圖2)。

表2 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞凋亡率的影響(n=5,%)

圖2 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞凋亡率的檢測

2.4 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞細胞周期的影響 各組材料浸提液作用于大鼠牙周膜細胞48h后，DMEM組的G0/G1期細胞周期比例最低，Prl指數最高。二氧化鋯組與DMEM組的G0/G1期細胞周期比例無統計學差異(P＞0.05)，鈀銀合金組、鎳鉻合金組的G0/G1期均高于前兩組，且差異有統計學意義(P＜0.05)，鈀銀合金組與鎳鉻合金組之間的G0/G1期無統計學差異(P＞0.05)。Prl指數從高到低依次為二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組，鈀銀合金組、鎳鉻合金組與二氧化鋯組相比，均有統計學差異(P＜0.05)，鈀銀合金組與鎳鉻合金組之間的Prl指數無統計學差異，見表3。

2.5 不同浸提液組處理對大鼠牙周膜細胞Caspase含量的影響 各組Caspase-3的 2-ΔΔCT值從數值上看由大到小依次為：鎳鉻合金組＞DMEM組＞鈀銀合金組＞二氧化鋯組，二氧化鋯組、鈀銀合金組mRNA的相對表達量低于DMEM組，差異無統計學意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組mRNA的相對表達量高于DMEM組，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組 Caspase-8 的 2-ΔΔCT值從數值上看由大到小依次為：DMEM組＞鎳鉻合金組＞二氧化鋯組＞鈀銀合金組，二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組的mRNA相對表達量均低于DMEM組，但二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異有統計學意義(P＜0.05)，二氧化鋯組與鈀銀合金組之間差異無統計學差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于二氧化鋯組、鈀銀合金組，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組 Caspase-9 的 2-ΔΔCT值從數值上看由大到小依次為：鎳鉻合金組＞DMEM組＞二氧化鋯組＞鈀銀合金組，二氧化鋯組、鈀銀合金組mRNA的相對表達量低于DMEM組，差異無統計學意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組mRNA的相對表達量高于DMEM組，差異有統計學意義(P＜0.05)。具體見表4。

表3 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細胞細胞周期的影響(n=5,%)

表4 不同浸提液組處理對大鼠牙周膜細胞CaspasemRNA相對表達量(2-ΔΔCT 值)的比較(xˉ±SD， n=5)

3.討論

全瓷冠與金屬烤瓷冠在用于臨床牙冠修復時，不僅要考慮修復材料的耐磨性及強度外，還應考慮材料的生物相容性。金屬烤瓷冠的物理強度是可以滿足臨床冠修復的要求，但是對于牙齦的刺激性不容忽視。全瓷冠的組織相容性及耐腐蝕性均較理想，即使在齦溝液的持續作用下也基本不會有金屬離子的析出，因此對牙周組織的損傷較小[8]。對于二氧化鋯的研究，國內外多集中在它的細胞生物相容性、細胞生物學行為方面，例如細胞增殖率、毒性的分級、溶血能力等[9,10]，但對于其為何會產生如此結果的分子生物學行為，研究甚少。本研究從分子生物學行為入手，研究分析了二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠、鎳鉻合金烤瓷冠浸提液對大鼠牙周膜細胞的活性、細胞周期、凋亡及相關mRNA的表達的影響。

近年來，越來越多的實驗證實，牙周膜成纖維細胞的功能異常與牙周炎的發生、牙槽骨的吸收有密切的聯系，不同材料制作出的浸提液作用于牙周膜細胞，其損傷程度基本能反映出不同修復材料對牙周組織的損傷程度[11]。本實驗培養了大鼠的牙周膜細胞，經二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠、鎳鉻合金浸提液處理后，以CCK-8法檢測細胞的活性。經活力分析可知，二氧化鋯組、鈀銀合金組、DMEM組OD值兩兩比較均無統計學差異(P＞0.05)，而鎳鉻合金組OD值明顯高于其余各組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，說明二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠不會造成牙周膜細胞的損傷。流式細胞術是通過對DNA含量的計算來推算出細胞所處的細胞周期。所以，流式細胞術只能將G0/G1、S期、G2期的細胞區分開。細胞的Pr I指數為G2/M與S期占細胞總量的比例，它能夠反映細胞對DNA的復制能力。在流式細胞儀對細胞周期的檢測中也發現，能夠反映細胞增殖活力的Pr I指數，二氧化鋯的表現優于鈀銀合金及鎳鉻合金，這也從另一方面說明了二氧化鋯對細胞周期沒有抑制作用。

細胞凋亡是一個極復雜，且受控于多種基因的死亡過程，它大體可以分為三個階段：起始階段、效應階段、清除階段。它是一系列導致細胞解體的分子級聯反應，它需要凋亡受體的激活，凋亡誘導因子的活化，轉導后引起線粒體的變化，隨著核酸內切酶被激活，細胞即出現凋亡特有的表現，直至形成凋亡小體[12]。有學者提出，觀察細胞總RNA量結合細胞毒性實驗、分子生物學實驗可以作為綜合評價材料生物相容性的參考[13]。有學者應用RT-PCT方法來研究材料與細胞的交互過程，發現監測細胞的mRNA表達量可以作為反映細胞與材料間生物相容性的有效手段之一[14]。天冬氨酸特異性半胱胺酸蛋白酶(Caspases)家族是線粒體凋亡通路下游重要的執行分子。Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9均屬于Caspases家族。Caspases-8、Caspases-9作為啟動者，當得到信號時，可通過自剪接激活，從而引發Caspase的級聯反應，此時細胞凋亡開始；Caspases-3作為執行者，可使細胞內的結構蛋白、功能蛋白發揮作用，引起凋亡，但它不參與自剪接，這提示我們，可能仍存在其他的凋亡因子或凋亡途徑參與了細胞的凋亡反應[15]。本文對二氧化鋯、鈀銀合金、鎳鉻合金浸提液處理后的細胞Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達量進行了檢測，發現Caspase-3、Caspase-9 的 2-ΔΔCT值，二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異無統計學意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于DMEM組，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組 Caspase-8 的 2-ΔΔCT值，二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異有統計學意義(P＜0.05)，二氧化鋯組與鈀銀合金組之間差異無統計學差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于二氧化鋯組、鈀銀合金組，差異有統計學意義(P＜0.05)，二氧化鋯、鈀銀合金的 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達量并未增多，這與李菊等研究結果相似，二氧化鋯不會增加 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達量[16]；而鎳鉻合金的 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9mRNA相對表達量較高，這與林泓磊、王學等[17，18]利用流式細胞儀得出的鎳鉻合金會誘導細胞凋亡的結果相一致。由此，本研究認為，鎳鉻合金誘導細胞發生凋亡可能是由內源性途徑轉導細胞凋亡的信號，從而引發了細胞的凋亡。

綜上所述，二氧化鋯在提高細胞增殖活力，抑制細胞凋亡方面優于鈀銀合金及鎳鉻合金材料，其良好的生物相容性，不會影響牙周膜細胞的細胞活力、細胞周期、細胞凋亡以及相關基因的表達。但本實驗只對內源性的少數幾個相關基因的mRNA表達進行了研究，信號通路的傳導是一個復雜的過程，是否存在其它的凋亡因子或凋亡途徑仍需進一步的研究。

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