2種復(fù)合微生態(tài)制劑對大海馬幼魚生長存活及水質(zhì)影響

羅杰，李鋒，劉皓，曹伏君，王中鐸，袁吉貴

（廣東海洋大學(xué)南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

海馬是一種小型海洋魚類，分布于內(nèi)海海藻、海草生長繁茂的地方，以攝食小型甲殼類動物為主，我國沿海常見有大海馬、線紋海馬、三斑海馬、小海馬和刺海馬5種[1]。海馬由于個體較小，其經(jīng)濟價值主要體現(xiàn)在藥用方面，在我國素有“北方人參，南方海馬”之稱。隨著近海污染的加劇和人類對近岸海域過度開發(fā)，導(dǎo)致天然餌料數(shù)量減少及棲息環(huán)境惡化，而更為嚴重的是人類對海馬需求量日益增多而過度捕撈，其自然資源數(shù)量急劇減少[2]，世界生物保護組織把所有已知的33種海馬均列入瀕危野生動植物種[3]，我國2004年5月把海馬列入Ⅱ級保護動物。因此，進行海馬人工繁育及養(yǎng)殖技術(shù)研究尤為重要。大海馬（Hippocampus kuda）是我國海馬養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖品種，經(jīng)多年研究，在海馬人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)[4-12]、形態(tài)及生理生態(tài)學(xué)[13-18]、分子生物學(xué)[19-20]等方面研究取得較大進展，但其人工育苗及養(yǎng)殖成活率偏低的問題仍未得到有效的解決，而養(yǎng)殖過程中由于殘餌、管理不科學(xué)等原因造成水體中 pH、化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的大量積累，導(dǎo)致水體惡化，誘導(dǎo)疾病的發(fā)生，是大海馬人工育苗及養(yǎng)殖成活率偏低的原因之一。

微生態(tài)制劑（probiotics）也叫活菌制劑（bigone）或益生菌，是一類能夠調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進宿主正常菌群生長的制劑總稱[21]。用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、光合細菌、硝化細菌、反硝化細菌、EM菌等，具有抗病、促生長、凈化水質(zhì)、提高免疫功能、無毒無不良作用、無殘留、成本低、效果顯著、不污染環(huán)境等優(yōu)點[22-23]，對養(yǎng)殖水體修復(fù)[24]、提高水產(chǎn)動物人工育苗及養(yǎng)殖成活率、病害防控[25-32]等方面效果顯著。本文在大海馬人工育苗及養(yǎng)殖期間，通過投放在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的2種復(fù)合微生態(tài)制劑AQ菌和EM菌，研究二者對大海馬幼魚生長、存活及水質(zhì)的影響，以期為微生態(tài)制劑在海馬人工養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供更為詳實的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)施

實驗在湛江溢鑫源水產(chǎn)科技有限公司水產(chǎn)種苗繁育基地進行，所用的大海馬幼魚由基地提供，體長（1.13±0.07）cm，試驗海水溫度 28.5～29.2 ℃、鹽度（30.0±0.5）、pH 值 8.2，經(jīng)沉淀、砂濾后使用。

二種復(fù)合微生態(tài)制劑分別為AQ菌和EM菌，其中AQ菌為上海綠奧生物科技有限公司生產(chǎn)，粉末狀，包括Bacillus mageterium、硝化細菌、芽孢桿菌等多種有益菌及復(fù)合酶、營養(yǎng)劑，有效活菌含量不低于 20×108CFU/g；EM菌由山東寶來利來生物工程股份有限公司生產(chǎn)，主要成分為乳酸菌、酵母菌、放線菌、沼澤紅假單胞菌、絲狀菌等有益菌，活菌總數(shù)大于30×108CFU/mL。AQ菌加水配制成菌液后使用，配制比例為1 g/m3（固體粉末）=1 mL/m3（液體菌液）。

實驗所用的水泥池大小為1.0 m×1.0 m×1.0 m，每池安放2個氣石，微沖氣。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計 實驗在小水泥池中進行，水泥池經(jīng)消毒處理，加入經(jīng)砂濾的海水90 cm。設(shè)1個沒有投放復(fù)合微生態(tài)制劑的空白對照組和2個試驗組，其中試驗組A加入微生態(tài)制劑AQ菌4.5 mL，試驗組B加入EM菌3.0 mL，使養(yǎng)殖水體中有益菌濃度約為1×104CFU/mL，每個試驗組設(shè)3個重復(fù)。每個小水泥池投放大小為（1.13±0.07）cm的大海馬幼魚250尾，實驗時間為35 d。

1.2.2 日常管理 每天上午用虹吸方法把池中的臟物、殘餌吸掉，死魚及時撈出，然后換水，換水量為50%～60%，換的水溫盡量與原水溫保持一致，防止溫差變化太大造成應(yīng)激反應(yīng)，根據(jù)換水量的多少追加投放適量的微生態(tài)制劑，使水體中的有益菌濃度維持在1×104CFU/mL左右。餌料主要為鹵蟲幼體、糠蝦等，每天投餌3次，每次以水中有少量剩餌為宜。

1.3 生長及水質(zhì)指標測定

實驗結(jié)束后，每組取15尾海馬幼魚用游標卡尺測量體長，統(tǒng)計存活的幼魚數(shù)量，最后計算體長特定生長率R（%/d）及成活率A（%）：

式中Ht、H0分別為實驗結(jié)束時幼魚的平均體長、起始體長，d為實驗時間。

A=（實驗各階段或結(jié)束時幼魚存活數(shù)/實驗起始幼魚總數(shù)）×100%。

每隔5 d，在換水前測定試驗池中的pH值、COD、NH4+-N和NO2--N含量，測定儀器及方法分別采用美國OHRUS ST10型酸度計、高錳酸鉀法、次溴酸鈉氧化法（以722s紫外分光光度計測定吸光值）、鹽酸萘乙二胺比色法[33]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，利用Duncan進行多重分析比較，統(tǒng)計學(xué)意義差異水平規(guī)定為P＜0.05。實驗數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差（Mean±SE）。

2 結(jié)果

2.1 不同微生態(tài)制劑對大海馬幼魚生長的影響

經(jīng)過35 d實驗，投放AQ菌、EM菌和對照組的大海馬幼魚生長、存活結(jié)果見表1。從表1中可以看到，對照組的幼魚體長特定生長率最低，而投放AQ菌、EM 菌組的分別為 （12.79±1.87）%/d、（13.22±1.52）%/d，EM菌組幼魚比對照組的體長增加了5.8%。Duncan多重顯分析比較，投放微生態(tài)制劑的A、B組的大海馬幼魚體長特定生長率與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而A、B兩組之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在成活率方面，A、B組相差不大，對照組最低，只有51.6%，但與A、B組相比較，成活率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同實驗組對大海馬幼魚生長與存活的影響

2.2 不同微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

圖1 不同微生態(tài)制劑處理水體中pH的變化

2.2.1 pH值含量的影響 從圖1中看出，兩種微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體的pH值具有明顯的提高作用。試驗到第5天，pH值的差異就逐漸顯示出來，實驗結(jié)束時對照組的pH值下降至7.4，而兩種微生態(tài)制劑AQ、EM的pH值始終處于7.7～8.2之間，保持在動物較佳生長范圍。多重分析比較，對照組與實驗組之間均無統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＞0.05）。

2.2.2 水體中化學(xué)需氧量（COD）含量的影響 對照組、投放微生態(tài)制劑的實驗組對養(yǎng)殖過程中化學(xué)需氧量（COD）含量影響見圖2，投放微生態(tài)制劑對水體中的化學(xué)需氧量具有明顯的降低作用。沒有施放微生態(tài)制劑的對照組，從第5天開始到實驗結(jié)束，COD始終處于上升狀態(tài)，結(jié)束時達到4.68 mg/L，與實驗組均有統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＜0.05）；而EM、AQ組，水體中COD的含量保持在較低水平，尤其是EM組效果更好，實驗結(jié)束時只有3.23 mg/L，比對照組降低了31%。但兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＞0.05）。

2.2.3 水體中氨氮（NH4+-N）含量的變化 微生態(tài)制劑對水中NH4+-N含量的影響見圖3。實驗組EM、AQ水體中NH4+-N的含量只是緩慢上升，始終維持在0.118～0.204 mg/L，沒有統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＞0.05）；而對照組的NH4+-N含量變化幅度較大，結(jié)束時其含量達到0.423 mg/L，與加入復(fù)合微生態(tài)制劑組最低相比，水體中NH4+-N含量增加了107.4%，而且表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＜0.05）。

圖2 水體中化學(xué)需氧量（COD）含量的變化

圖3 水體中氨氮（NH4+-N）含量的變化

2.2.4 水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）含量的變化從圖4中可見，微生態(tài)制劑可明顯降低水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）的含量。實驗第5天，對照組與實驗組水中NO2--N含量相差不大，而隨著實驗的繼續(xù)，微生態(tài)微制劑組與對照組水中NO2--N的含量表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＜0.05），至實驗結(jié)束時沒有加入微生態(tài)制劑的對照組水中NO2--N為0.183 mg/L，是含量最低（只有0.058 mg/L）的微生態(tài)制劑AQ的3倍多。

圖4 水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）含量的變化

3 結(jié)論與討論

水生動物在養(yǎng)殖過程中，由于自身的排泄、人工投餌等諸多因素影響，致使水體中氨氮、H2S、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量不斷積累，增加了水產(chǎn)動物患病的風(fēng)險。水產(chǎn)動物傳統(tǒng)的防病治病常常采用投放過量的抗生素，實踐證明，過多使用抗生素，一些常見的水產(chǎn)動物病害已產(chǎn)生抗藥性及可導(dǎo)致動物自身免疫力下降，破壞養(yǎng)殖水體的生態(tài)系統(tǒng)，同時抗生素對環(huán)境容易造成污染、影響水產(chǎn)動物的風(fēng)味等。因此，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用受到越來越多的養(yǎng)殖者青睞，它具有無毒、無不良作用、無殘留和不產(chǎn)生抗藥性等特點，能夠有效改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)水體質(zhì)量、消除氨氮等污染、增強養(yǎng)殖對象的免疫力，在健康水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮十分重要的作用。

3.1 微生態(tài)制劑對大海馬幼魚生長與存活的影響

由于微生態(tài)制劑本身含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，同時隨著它們在動物消化道內(nèi)的定植、繁衍和代謝，可產(chǎn)生動物生長所需的維生素、氨基酸、促生長因子以及蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維酶等多種酶，從而增強養(yǎng)殖對象的營養(yǎng)代謝，增加機體對養(yǎng)分的消化利用，促進其生長。

另一方面，微生態(tài)制劑還可通過競爭抑制以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制有害細菌，從而起到預(yù)防病害的作用[25]。大量的研究結(jié)果表明，在養(yǎng)殖水體中施加微生態(tài)制劑可促進水生動物生長及增加其免疫力。武鵬等[25]研究了3種微生態(tài)制劑對水質(zhì)及刺參幼參生長的影響，微生態(tài)制劑均能提高幼參的特定生長率，同時提高幼參體腔液中的酸性磷酸酶、過氧化氫酶、溶菌酶活力；在凡納濱對蝦育苗中，投放微生態(tài)制劑可縮短幼體變態(tài)時間和提高成活率[34]；在牙鲆幼魚養(yǎng)殖中加入微生態(tài)制劑，可顯著提高牙鲆幼魚消化道的蛋白酶活性，對牙鲆幼魚生長有顯著的促進作用[35]。本試驗從表1中可以看出，同一規(guī)格的大海馬幼魚經(jīng)過35 d的養(yǎng)殖試驗，在加入微生態(tài)制劑的A、B組，大海馬幼魚的特定生長率均比對照組的高，有統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＜0.05）；兩種微生態(tài)制劑都可以提高大海馬幼魚的成活率，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。微生態(tài)制劑能夠提高水產(chǎn)動物的成活率，在相關(guān)研究文獻中已經(jīng)得到證實[36-37]。

3.2 微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體中pH、COD、NH4+-N和NO2--N含量影響

在水體中加入微生態(tài)制劑，其中的有益微生物能夠發(fā)揮其氧化、氨化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用，迅速分解水中的排泄物、殘餌、動植物殘骸等有機物，降低氨態(tài)氮、硫化氫、COD等有害物質(zhì)的含量，并可通過反硝化作用去除亞硝酸鹽等污染物，間接增加水中的溶氧量。另外，通過加入有益微生物形成優(yōu)勢種群，與有害病原菌形成競爭，限制其生長，而且部分有益微生物的代謝產(chǎn)物具有殺菌抑菌作用，從而達到預(yù)防水產(chǎn)疾病的作用。還有，微生態(tài)制劑可促進養(yǎng)殖水體中原生動物、輪蟲、枝角類等動物性餌料大量繁殖，實現(xiàn)浮游植物的結(jié)構(gòu)由單一種群向多種群轉(zhuǎn)變，優(yōu)勢種類轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭毎孱?。在降解淤泥、抑制有害微生物和有害藻類的繁殖、平衡養(yǎng)殖水體的微生態(tài)環(huán)境等方面可起到積極作用。微生態(tài)制劑通過以上途徑實現(xiàn)改善水質(zhì)。

試驗中，無論是對照組還是加入微生態(tài)制劑的實驗組，水體中pH、COD、NH4+-N和NO2--N的含量均隨著養(yǎng)殖時間的延長而增加，只不過實驗組的增加比較緩慢，而對照組增加較快（見圖 1、2、3、4），可見微生態(tài)制劑可延緩水中pH下降，使其維持在一個適宜的范圍。同樣，微生態(tài)制劑對水體中的COD、NH4+-N和NO2--N只是起到一定的降解作用，并不能完全消除水中的有害物質(zhì)。2種微生態(tài)制劑EM菌和AQ菌由于其所含的有益菌種類不同，故二者對水中的COD、NH4+-N和NO2--N降解效果也有所差別，EM菌對降低COD、NH4+-N的含量效果較好，而AQ菌由于含有硝化細菌，其對NO2--N的降解效果更好。從上述實驗結(jié)果來看，無論對大海馬幼魚的生長還是對水中 pH、COD、NH4+-N和NO2--N含量的影響，EM菌和AQ菌的效果相差不大。在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中由于微生態(tài)制劑使用量較大，從經(jīng)濟效益出發(fā)，在二者中可以選擇價廉的進行使用，以提高經(jīng)濟效益。

[1]張璐，李靜，魏萬權(quán).海馬的生物學(xué)特性及其增養(yǎng)殖技術(shù)[J].中國水產(chǎn)，2004（7）：62-63.

[2]呂軍儀，許實波.海馬工廠化健康養(yǎng)殖成果及開發(fā)前景[J].中藥材，2001，24（9）：629-631.

[3]Cites．Seahorses and other members of the family Syngnathidae （decision 12.54）[R].Report of the working group.AC20 Doc.17.Convention on internationaltrade in endangered species of wild fauna and flora （CITES），twentieth meeting of the animals committee Johannesbur（South Africa），2004.

[4]杜慶紅，陳栩，朱長壽，等.大海馬人工繁殖和育苗技術(shù)研究[J].臺灣海峽，2004，23（2）：186-191.

[5]Koldewey H J，Martin Smith K M．A global review of seahorse aquaculture[J].Aquaculture，2010（302）：131-152．

[6]魏祥東，葉長明，陳東紅.餌料對幼海馬生長的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報，2003，42（3）：60-63.

[7]趙平孫，文子能，周生祿.人工養(yǎng)殖條件下大海馬幼魚的生長[J].海洋水產(chǎn)研究，2003，24（3）：15-19.

[8]Iin Q，Zhang D，Lin J D.Effects of light intensity，stocking density，feeding frequency and salinity on the growth of sub adult seahorses Hippocampus erectus Perry[J].Aquaculture，2009（292）：111-116.

[9]呂軍儀，吳金英，楊大偉，等.大海馬在人工養(yǎng)殖條件下的生長速率[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2001，8（1）：59-63.

[10]戴廣譜，徐永健，孫彬.大海馬幼苗人工養(yǎng)殖條件的研究[J].漁業(yè)科學(xué)進展，2011，32（4）：62-66.

[11]李景，徐永健.大海馬交配和孵化適宜環(huán)境條件研究[J].生態(tài)科學(xué)，2014，33（4）：730-734.

[12]王韓信，劉曉東，張東，等.冷凍和鮮活糠蝦對灰海馬繁殖力的影響[J].水產(chǎn)科技情報，2012，39（1）：6-9.

[13]王子暉，徐永健，李響.大海馬（Hippocampus kuda Bleeker）幼體口吻部骨骼形態(tài)觀察及其對攝食的影響[J].漁業(yè)科學(xué)進展，2015，36（5）：126-130.

[14]林強，呂軍儀，張彬，等.大海馬消化系統(tǒng)胚后發(fā)育的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)研究[J].熱帶海洋學(xué)報，2007，26（6）：46-51.

[15]Woods C.M.C.Effects of varying Artemia enrichment on growth and survival of juvenile seahorses，Hippocampus abdominalis[J].Aquaculture，2003（220）：537-548．

[16]尹飛，唐保軍，張東.營養(yǎng)強化對灰海馬幼體氨基酸組成的影響及品質(zhì)的評價[J].海洋漁業(yè)，2011，33（3）：310-318.

[17]席寅峰，張東，施兆鴻.投喂頻率對雌雄分化后灰海馬生長發(fā)育、餌料轉(zhuǎn)換效率及消化酶活力的影響[J].海洋漁業(yè)，2013，35（1）:77-85.

[18]尹飛，唐保軍，張東，等.投喂不同密度鹵蟲無節(jié)幼體對灰海馬幼體生長和存活的影響 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2012，18（4）：617-622.

[19]吳平，周開亞，張朝暉，等.海馬類藥材的分子遺傳標記鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1998，33（3）：226-233.

[20]Teske P.R，Hamilton H，Palsboll P J，et al.Molecular evidence for long-distance colonization in an Indo-Pacific seahorse lineasg[J].Marine Ecology Progress Series，2005（286）：249-260.

[21]吳保承，沈國強，楊春霞，等.微生態(tài)制劑在水質(zhì)凈化中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33（12）：408-410.

[22]田功太，劉飛，段登選，等．EM菌對海參養(yǎng)殖水體理化因子的影響[J]．水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33（1）：75-79.

[23]李加雙，劉彤，黃忠剛，等．水質(zhì)凈化芽孢桿菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]．大連工業(yè)大學(xué)報，2014，33（6）：404-408.

[24]張連水，張青松，孟會賢，等.高效復(fù)合微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體修復(fù)效應(yīng)的研究[J].河北漁業(yè)，2015（9）：16-18.

[25]武鵬，趙大千，蔡歡歡，等.3種微生態(tài)制劑對水質(zhì)及刺參幼參生長的影響 [J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28（1）：21-26.

[26]王吉橋，張凱，袁成玉，等.不同比例微藻和微生態(tài)制劑對仿刺參幼參生長的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2013，23（9）：524-530.

[27]吉遠軍，李家勝，陸峰，等.復(fù)合微生態(tài)制劑AQ在南美白對蝦養(yǎng)殖中應(yīng)用效果[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2012（5）:15-16.

[28]李曉英，董志國，閻斌倫，等.復(fù)合微生態(tài)制劑對中國對蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)和生長性能的影響 [J].中國飼料，2007（19）：27-29.

[29]周可，謝鳳行，張峰峰，等.水產(chǎn)養(yǎng)殖復(fù)合微生態(tài)制劑使用技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，22（5）：50-53.

[30]郝佳，蔡明城，陳文博，等.幾種微生態(tài)制劑對刺參生長和養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響[J].經(jīng)濟動物學(xué)報，2015，19（2）：67-73.

[31]胡京，董琦，張春巖，等.兩種EM菌劑對養(yǎng)殖水體水質(zhì)及幼刺參生長性能的影響 [J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，35（2）：79-83.

[32]白海鋒，于麗娜，劉鐵鋼，等.微生態(tài)制劑對幼刺參越冬成活率及生長的影響[J].河北漁業(yè)，2012（1）：5-8.

[33]雷衍之.養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實驗[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：31-72．

[34]劉建勇.復(fù)合微生物制劑在凡納濱對蝦育苗中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué)，2005，29（4）：36-40.

[35]馮俊榮，陳營，杜榮斌，等.微生態(tài)制劑對牙鲆幼魚蛋白酶和生長的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2005（12）：36-38.

[36]劉曉東，張琴，王韓信，等.芽孢桿菌微生態(tài)制劑對灰海馬幼體生長、成活率及消化酶活力的影響[J].水產(chǎn)科技情報，2015，42（3）：119-123.

[37]白海鋒，于麗娜，劉鐵鋼，等.微生態(tài)制劑對幼刺參越冬成活率及生長的影響[J].河北漁業(yè)，2012（1）：5-8.