微生物合成納米靈菌紅素及其對(duì)羊毛織物抗菌染色

任燕飛， 鞏繼賢， 付冉冉， 張健飛， 王富邦， 陶宇慶(.天津工業(yè)大學(xué) 紡織學(xué)院， 天津 300387； 2.天津工業(yè)大學(xué) 先進(jìn)紡織復(fù)合材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300387)

隨著國(guó)家對(duì)可再生資源重視程度的提高，天然染料以其良好的生物降解性、可持續(xù)性以及對(duì)人體皮膚的的無(wú)毒低刺激性而日益成為紡織品染色領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1-2]。其中微生物染料/色素的生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地域的限制，同時(shí)種類豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短，將逐漸成為天然染料的主要來(lái)源[3-4]。

作為一種極具潛力的微生物染料，靈菌紅素由于具有鮮艷的顏色、良好的熱穩(wěn)定性以及某些功能性而逐漸成為研究熱點(diǎn)。靈菌紅素是一類微生物紅色素的統(tǒng)稱，主體結(jié)構(gòu)為三聚吡咯，其中 2-甲基-3-戊基-6甲氧基三聚吡咯是此類色素的典型代表。可產(chǎn)生靈菌紅素的微生物有黏質(zhì)沙雷氏菌、產(chǎn)氣弧菌以及一些放線菌[4-5]。使用靈菌紅素對(duì)蛋白質(zhì)纖維織物染色，國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道，但是由于靈菌紅素為胞內(nèi)色素，需要使用有機(jī)溶劑將色素提取出來(lái)。同時(shí)，靈菌紅素幾乎不溶于水，制備染液時(shí)同樣需要使用有機(jī)溶劑溶解色素。有機(jī)溶劑的使用既提高了成本,又與天然染料綠色環(huán)保的宗旨不符[6-7]。

本文使用黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵直接制備了靈菌紅素納米分散液，表征分析了此分散體系的粒徑分布和色素濃度，以此作為染液對(duì)羊毛織物染色，系統(tǒng)地研究了染色條件對(duì)織物顏色和抗菌性能的影響。染液的制備及染色過(guò)程完全避免了有機(jī)溶劑的使用，綠色環(huán)保，且此方法具有普遍適用性，可推廣至其他非水溶性的微生物胞內(nèi)色素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

織物：平紋羊毛織物，面密度為125 g/m2，經(jīng)密為210 根/(10 cm)，緯密為180 根/(10 cm)，購(gòu)自上海市紡織工業(yè)技術(shù)監(jiān)督所。

菌種：黏質(zhì)沙雷氏菌 (ATCC 8100)、金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)和大腸桿菌 (ATCC 8739)，均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

試劑：靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)，購(gòu)自英國(guó)Abcam貿(mào)易有限公司；丙三醇、吐溫-80、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉、瓊脂粉，均由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

儀器：DelsaNano C型激光粒度分析儀，美國(guó)Beckman Coulter公司；UV-6100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；ECO紅外染色機(jī)、Datacolor SF-600型測(cè)色配色儀，美國(guó)Datacolor公司；LRH-150 型生化恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司；Scan-500型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，法國(guó)Interscience公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1納米靈菌紅素染液的制備

將活化后的黏質(zhì)沙雷氏菌接種至種子培養(yǎng)液中，在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)20 h。然后將黏質(zhì)沙雷氏菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28 ℃、200 r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后，使用離心機(jī)在10 000 r/min、10 ℃條件下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，時(shí)間為10 min，去除菌體后得到納米靈菌紅素染液。

種子培養(yǎng)液：5 g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨、3 g/L氯化鈉、2 g/L氯化鉀。

發(fā)酵培養(yǎng)液：蛋白胨 15 g/L、0.3%丙三醇、1.8%吐溫-80、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈉、2 g/L氯化鉀。

1.2.2靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1 mg靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10 mL 90%酸性乙醇水溶液中，pH值為3，以此作為母液進(jìn)行梯度稀釋，分別測(cè)定稀釋后溶液在535 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度，繪制靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)吸光度的擬合直線。

1.2.3納米靈菌紅素染液對(duì)羊毛織物染色

在紅外染色機(jī)中使用制備得到的納米靈菌紅素染液對(duì)羊毛織物染色，工藝如圖1所示。室溫入染，升溫速率為3 ℃/min，浴比為1∶40。分別探究染色溫度、時(shí)間及染浴pH值對(duì)染色效果的影響。

圖1 染色工藝曲線Fig.1 Dyeing process curve

1.3 測(cè)試方法

1.3.1粒徑測(cè)試

使用DelsaNano C型激光粒度分析儀測(cè)定納米靈菌紅素的粒徑分布及多分散指數(shù)，測(cè)試模式選擇CONTIN，測(cè)試溫度為25 ℃，每次測(cè)試重復(fù)3次。

1.3.2K/S值及顏色特征值測(cè)試

使用Datacolor SF-600型測(cè)色配色儀測(cè)定染色羊毛織物的K/S值及L*、a*、b*值。

1.3.3染色牢度測(cè)試

耐摩擦色牢度根據(jù)GB/T 3920—2008《紡織品 色牢度試驗(yàn) 耐摩擦色牢度》測(cè)定；耐皂洗色牢度根據(jù)GB/T 3921—2008《紡織品 色牢度試驗(yàn) 耐皂洗色牢度》測(cè)定；耐汗?jié)n色牢度根據(jù)GB/T 3922—2013《紡織品 色牢度試驗(yàn) 耐汗?jié)n色牢度》測(cè)定；耐曬色牢度根據(jù)GB/T 8427—2008《紡織品 色牢度試驗(yàn) 耐人造光色牢度：氙弧》測(cè)定。

1.3.4抗菌性能測(cè)試

根據(jù)GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評(píng)價(jià) 第3部分：振蕩法》對(duì)染色羊毛織物進(jìn)行抗菌性能測(cè)試，對(duì)照樣采用未經(jīng)染色的羊毛織物。實(shí)驗(yàn)菌種為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。原織物和染色織物分別接觸振蕩菌液，溫度為24 ℃，時(shí)間為18 h，菌液濃度為2×104～3×104CFU/mL。接觸振蕩后用10倍稀釋法稀釋菌液并涂平板，其中大腸桿菌稀釋5次，金黃色葡萄球菌稀釋4次，通過(guò)所涂平板上的菌落數(shù)計(jì)算振蕩接觸織物后的菌液濃度。抑菌率計(jì)算公式為

式中：R為染色羊毛織物的抑菌率，%；A為未經(jīng)染色的羊毛織物振蕩接觸菌液后燒瓶?jī)?nèi)的菌液濃度，CFU/mL；B為染色羊毛織物振蕩接觸菌液后燒瓶?jī)?nèi)的菌液濃度，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米靈菌紅素染液的制備

圖2示出納米靈菌紅素染液的制備過(guò)程。

圖2 納米靈菌紅素染液制備過(guò)程Fig.2 Preparation of nano prodigiosins

靈菌紅素幾乎不溶于水，為胞內(nèi)色素，在常規(guī)的發(fā)酵液中大部分色素存在于菌體內(nèi)部。通過(guò)在發(fā)酵液中添加非離子表面活性劑吐溫-80，可提高細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使在菌體內(nèi)部合成的色素向外轉(zhuǎn)移。同時(shí)，發(fā)酵液中非水溶性的靈菌紅素會(huì)被非離子表面活性劑包覆，形成色素的膠束體系，極大程度上降低了發(fā)酵液中游離靈菌紅素的濃度，這進(jìn)一步促進(jìn)了胞內(nèi)色素向外轉(zhuǎn)移，形成更多的靈菌紅素-吐溫-80膠束[8-9]。發(fā)酵結(jié)束后去除菌體，即得到納米靈菌紅素分散液，以此作為染液進(jìn)行后續(xù)的染色實(shí)驗(yàn)。

2.2 納米靈菌紅素的粒徑分布

圖3示出納米靈菌紅素分散液的粒徑分布。粒徑分布在152.4～648.4 nm之間；色素的平均粒徑為285.8 nm；多分散指數(shù)為0.193，表明納米靈菌紅素的粒徑分布集中。納米級(jí)的色素分散系以及集中的粒徑分布既可保證分散液的均一穩(wěn)定，又可保證染色織物的勻染性。

圖3 納米靈菌紅素分散液粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of prodigiosins nano-dispersion

2.3 納米靈菌紅素染液色素質(zhì)量濃度

圖4示出靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合得到的線性回歸方程為

y=0.278 84x+0.009 97,R2=0.999 94

圖4 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度擬合直線Fig.4 Fitting straight line of concentration and absorbance of prodigiosin standard

式中：x為色素質(zhì)量濃度，mg/L；y為吸光度。

使用pH值為3的90%乙醇溶液稀釋納米靈菌紅素染液，經(jīng)離心去除不溶物后，測(cè)定535 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度，經(jīng)過(guò)計(jì)算得到納米靈菌紅素染液中色素的質(zhì)量濃度為18.3 mg/L。

2.4 染色溫度對(duì)染色效果的影響

溫度是羊毛織物染色過(guò)程中非常重要的因素，圖5和表1示出溫度對(duì)羊毛織物染色效果的影響，染色時(shí)間設(shè)為30 min。隨著染色溫度的升高，織物色深度逐漸加深，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，羊毛織物的K/S值最大。染色溫度為100 ℃時(shí)，色深度略有下降。同時(shí)羊毛織物的顏色變得晦暗，這可能是由于在長(zhǎng)時(shí)間的高溫條件下，且染罐中有一定壓力，靈菌紅素分子上的亞氨基與羊毛蛋白分子中的某些氨基酸發(fā)生微弱的反應(yīng)，破壞了色素的發(fā)色團(tuán)，因此，最適染色溫度為90 ℃。

圖5 不同溫度染色羊毛織物Fig.5 Dyed wool fabrics under different temperatures

表1 不同溫度下羊毛織物的染色效果Tab.1 Dyeing effect of wool fabrics dyed under different temperatures

2.5 染色時(shí)間對(duì)色深度的影響

圖6示出染色時(shí)間對(duì)羊毛織物色深度的影響。隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)，織物K/S值逐漸增加，直到纖維表面與內(nèi)部的染料濃度達(dá)到平衡。當(dāng)染色時(shí)間超過(guò)20 min后，色深度逐漸下降，這是由于靈菌紅素分散系在長(zhǎng)時(shí)間的高溫下逐漸破壞，染浴中染料聚集的機(jī)會(huì)增多，聚集程度增大，靈菌紅素發(fā)生沉降，染色平衡被打破, 染料的解析大于吸附, 所以染色羊毛織物的K/S值開(kāi)始下降。因此，最優(yōu)染色時(shí)間為20 min。

圖6 染色時(shí)間對(duì)羊毛織物色深度的影響Fig.6 Effect of dyeing time on color depth of dyed wool

2.6 染液pH值對(duì)染色效果的影響

經(jīng)測(cè)定，納米靈菌紅素分散液的pH值為8.1。由于羊毛耐酸不耐堿，對(duì)羊毛織物的染色需要在酸性或中性條件下進(jìn)行，分別調(diào)節(jié)納米靈菌紅素染液的pH值為2.1、4.1、6.1和8.1，在最適染色溫度和時(shí)間下對(duì)羊毛織物染色，結(jié)果如圖7及表2所示。可以看出，染液pH值對(duì)染色效果影響明顯，其中當(dāng)pH值為2.1時(shí)，羊毛織物的顏色最深。這是由于隨著pH值的降低，靈菌紅素在水中的溶解度會(huì)增加，染料只有在溶解狀態(tài)下才能上染羊毛纖維，溶解度的提高會(huì)增加染料的上染。靈菌紅素的等電點(diǎn)在9.7左右[10]，羊毛織物的等電點(diǎn)在4.2～4.8之間，當(dāng)染液pH值為6.1和8.1時(shí)，羊毛織物帶負(fù)電，靈菌紅素帶正電，電荷引力促進(jìn)色素向纖維轉(zhuǎn)移，羊毛織物的色深度比染液pH值為4.1時(shí)要高。

圖7 不同pH值染色羊毛織物Fig.7 Dyed wool fabrics under different pH values

表2 不同pH值的染液中羊毛織物的染色效果Tab.2 Dyeing effect of wool fabrics dyed under different pH values

當(dāng)染液pH值為2.1時(shí)，羊毛織物的b*值為負(fù)，織物表現(xiàn)出略帶藍(lán)光，這是靈菌紅素的顏色對(duì)pH值敏感所導(dǎo)致的。圖8示出靈菌紅素乙醇溶液在不同pH值下的顏色情況。靈菌紅素在酸性條件下呈紫紅色，隨著pH值的增大，色素逐漸由紫紅色變?yōu)榧t色，而后變?yōu)槌壬⒆罱K呈現(xiàn)黃色[8]。結(jié)合表2中羊毛織物的染色效果可推測(cè)，染色后羊毛纖維內(nèi)部環(huán)境的pH值在8左右。當(dāng)染液pH值為2.1時(shí)，靈菌紅素以結(jié)合了大量氫離子的形式上染，顏色由淺紅色向紫紅色轉(zhuǎn)變，染色織物表現(xiàn)出略帶藍(lán)光。

圖8 pH值對(duì)靈菌紅素溶液顏色的影響Fig.8 Effect of pH value on color of prodigiosins solution

2.7 抗菌性

抗菌測(cè)試所涂平板如圖9、10所示。可明顯看出，不同pH條件下納米靈菌紅素染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)均有明顯的抑制作用，而對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑制作用并不顯著，這與靈菌紅素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的抑菌機(jī)制不同有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，靈菌紅素會(huì)阻礙大腸桿菌的核糖體(RNA)和蛋白質(zhì)的合成，阻止細(xì)胞分裂，破壞外膜完整性并抑制細(xì)胞呼吸，但是靈菌紅素并不能殺死或溶解大腸桿菌，只是抑制它們的分裂和代謝。相比之下，靈菌紅素可以誘導(dǎo)革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生自溶酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶解與死亡[11-12]，因此，靈菌紅素染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率明顯高于大腸桿菌。

圖9 不同pH值染色織物金黃色葡萄球菌抗菌實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)Fig.9 Colony counts from fabrics dyed under different pH values against S. aureus. (a) Original fabric (585 CFU); (b) pH=2.1 (5 CFU); (c) pH=4.1 (8 CFU); (d) pH=6.1 (15 CFU); (e) pH=8.1 (27 CFU)

圖10 不同pH值染色織物大腸桿菌抗菌實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)Fig.10 Colony counts from fabrics dyed under different pH values against E. coli. (a) Original fabric (101 CFU); (b) pH=2.1 (64 CFU); (c) pH=4.1 (66 CFU); (d) pH=6.1 (68 CFU); (e) pH=8.1 (72 CFU)

對(duì)圖9、10抗菌實(shí)驗(yàn)平板菌落計(jì)數(shù)， 計(jì)算染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率，如圖11所示。當(dāng)染液pH值為2.1時(shí)，染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率最高，分別為99.1%和36.6%。抑菌率的不同一方面與織物色深度即靈菌紅素的上染量有關(guān)，另一方面與染色過(guò)程染液的pH值有關(guān)。細(xì)菌帶負(fù)電荷，由于靈菌紅素的等電點(diǎn)在9.7左右，染液pH越小，靈菌紅素所帶正電荷越大，這促進(jìn)了靈菌紅素與細(xì)菌的吸附接觸，從而表現(xiàn)為抑菌率的提高。結(jié)合圖7、表2中織物的染色效果以及圖11中織物的抗菌性，選定最適染液pH值為2.1。

圖11 染色羊毛織物的抑菌率Fig.11 Antibacterial ratio of dyed wool fabrics

2.8 染色羊毛織物的染色牢度

在最優(yōu)工藝(溫度為90 ℃，時(shí)間為20 min，染液pH值為2.1)條件下，染色羊毛織物色牢度如表3所示。染色后羊毛織物經(jīng)過(guò)皂煮去除浮色，耐摩擦和皂洗色牢度均較高，耐汗?jié)n色牢度同樣在4級(jí)以上，可以滿足服用要求。然而日曬牢度僅為1級(jí)，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致，包括靈菌紅素在內(nèi)的絕大多數(shù)微生物色素的光穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其染色后的織物日曬牢度低。如何提高微生物染料的光穩(wěn)定性，提升染色織物的日曬牢度將成為微生物染料在紡織染色領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

表3染色羊毛織物的色牢度

Tab.3Fastnesspropertiesofdyedwoolfabrics級(jí)

3 結(jié) 論

1) 通過(guò)微生物發(fā)酵制備得到的納米靈菌紅素分散液的平均粒徑為285.8 nm，多分散指數(shù)為0.193，粒徑分布集中，色素分散液均一穩(wěn)定。納米靈菌紅素染液中靈菌紅素的質(zhì)量濃度為18.3 mg/L。

2) 納米靈菌紅素對(duì)羊毛織物染色的最優(yōu)工藝為：染色溫度90 ℃，時(shí)間20 min，染液pH值2.1。此時(shí)染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率均最高，分別為99.1%和36.6%。納米靈菌紅素染色羊毛織物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌。

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