黃曲霉真菌DNA提取方法考察及產毒菌株的鑒別

雷果平 王福 楊楸楠 陳仕偉

【摘要】目的：探索一種黃曲霉DNA快速提取、產毒菌株快速鑒別的檢測方法。方法：首次比較考察了CTAB法、試劑盒法與改良堿裂解法對黃曲霉菌株DNA提取的優缺點，并采用特異性PCR對黃曲霉菌株進行產毒陰陽性鑒別。結果：改良堿裂解法可在10min內提取黃曲霉DNA，黃曲霉產毒菌株特異性PCR結果顯陽性，其他菌株顯陰性。結論：改良堿裂解法可快速提取黃曲霉DNA，特異性PCR可對黃曲霉產毒菌株進行快速分子鑒定。

【關鍵詞】黃曲霉;DNA提取;產毒菌株;鑒定

黃曲霉（Aspergillus flavus）是一種腐生型好氧真菌，其次級代謝產生的黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種強致癌性劇毒物質，引起世界廣泛關注。對黃曲霉菌DNA的高效提取及菌株產毒陰陽性的快速鑒別研究對保障食品及中藥材的安全具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

黃曲霉產毒菌株（3.4408）與兩株黃曲霉非產毒菌株（3.0321、3.2572）采購于中國科學院微生物菌株保藏中心，其他黃曲霉、黑曲霉、普通青霉、朱黃青霉菌株均分離于中藥材陳皮表面。

1.2 實驗試劑

氫氧化鈉，無水乙醇，氯化鈉，異戊醇，苯酚，聚乙烯毗咯烷酮，DL2000Maker，瓊脂糖，苯酚，無水乙醇，氯仿，異戊醇，PVP，Tris-HCL（JieHui Biotech Co.，China），RNA酶（Tiangen Biotech Co.，China），植物DNA提取試劑盒（TiangenBiotech Co.，China），2×Taq PCRMasterMix（Tiangen Biotech Co.，China）;引物由上海生工（SangonCo.，China）合成。

1.3 實驗儀器

Retsch MM400球磨儀（德國萊馳公司）;PTC200PCR儀（美國BIO-Rad公司）;Ge1Dox XR凝膠成像系統（美國BIO-Rad公司）;DYI-8C電泳儀（北京六一儀器廠）：KRQ-300P人工氣候箱（重慶英博試驗儀器）。

2 實驗方法

2.1 DNA提取

2.1.1 CTAB法

取少許新鮮菌體（約20mg），加入液氮進行研磨，然后加入3ml 2%CTAB（加PVP），裝管;采用65 ℃水浴，時間為45min，采用13000r/min離心10min;取上清（水相）于一新離心管中，加等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），12000r/min離心10min;取上清，加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），12000r/min離心10min;取上清，加2L的無水乙醇和NaCl溶液，-20℃沉淀30min，12000r/min離心20min;收集沉淀，采用75酒精進行沖洗，利用超凈臺進行真空干燥;100μlTE溶解DNA，-20℃進保存備用。加入1μl的RNA酶，37℃水浴1h;加入400μl氯仿：異戊醇（24：1），12000r/min離心10min，重復2次。

2.1.2 試劑盒法（該方法按試劑盒操作說明方法進行）。

2.1.3 改良堿裂解法

取5mg菌體，加入80μl0.5mol/LNaOH，渦旋30s，加入160μl0.1mol/LTris-HC1中和，離心后取上清作模板備用。

2.2 ITS序列的PCR擴增與電泳

ITS序列擴增采用DNA條形碼通用引物ITS1/ITS4。PCR的反應條件以及擴增的程序均參考夏等的研究。PCR反應后取5μL反應液經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 結果

3.1 種黃曲霉DNA提取方法優缺點對比結果

從所用時間、試劑數量、儀器依賴度、有無毒性及耗費成本多方面比較CTAB法、試劑盒法及其改良堿裂解法提取黃曲霉DNA的優缺點，得出：改良堿裂解法用時最短，在耗費成本等方面均優于其他提取方法。

3.2 特異性PCR產物電泳結果

黃曲霉產毒菌株（3.4408）有一條明顯的PCR擴增條帶，而黃曲霉非產毒菌株（3.0321、3.2572）、黃曲霉菌株CPdI與CPd2、桔青素、黑曲霉、普通青霉以及朱黃青霉都沒有條帶產生。從實驗結果可以看出，其經一部地驗證了黃曲霉菌株（3.4408）為產毒菌株，而從中藥陳皮分離鑒定出的二株黃曲霉菌株及其他三種真菌均不具有產生毒素的能力，為產毒陰性菌株。

4 討論

PCR擴增技術被廣泛應用于多基原中藥材的鑒別，具有靈敏、特異及快速的優點。本研究根據黃曲霉產毒菌株關鍵基因aflR設計一對引物，通過實驗結果能夠看出該方法可以對黃曲霉產毒菌株進行有效鑒別。另外，在實驗中還發現黃曲霉產毒菌株在其生長后期會產生大量的黑色菌核，需要對其進行充分的重視。

同時在本研究之中，嘗試通過多重PCR以及DNA條形碼技術來對黃曲霉產毒菌株開展鑒別，通過實驗能夠發現多重PCR技術對產毒和非產毒菌株可以進行有效地鑒別，但PCR結果容易出現非特異性擴增，很容易出現假陽性的情況;在采用DNA條形碼技術來鑒別黃曲霉產毒菌株和非產毒菌株的過程之中發現，黃曲霉產毒菌株和非產毒菌株在ITS序列上存在有序列差異。

參考文獻

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