PDF2和ODF1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選牛卵泡發(fā)育相關(guān)基因

李鵬飛，孟金柱，郝慶玲，畢錫麟，王 鍇，朱芷葳，呂麗華*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2.銅仁學(xué)院烏江學(xué)院，銅仁 554300；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

動(dòng)物卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在卵泡發(fā)育的不同階段，一些特定基因?qū)β雅莸哪技⑦x擇和閉鎖起到了關(guān)鍵調(diào)控作用[1]。S.M.Romereim等[2]利用基因芯片技術(shù)對(duì)牛卵巢DF中GCs和膜細(xì)胞(Theca cells, TCs)以及黃體中的大黃體細(xì)胞(Large luteal cells, LLCs)和小黃體細(xì)胞(Small luteal cells, SLCs)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出大量調(diào)控牛卵泡發(fā)育和黃體形成的基因；E.Terenina等[3]對(duì)豬健康和閉鎖卵泡GCs進(jìn)行表達(dá)譜分析，共獲得1 684個(gè)重要調(diào)控基因，其中高表達(dá)基因287個(gè)，篩選出11個(gè)卵泡閉鎖的標(biāo)記基因。課題組前期也對(duì)PDF1和ODF1卵泡進(jìn)行了Illumina平臺(tái)測(cè)序，共獲得42個(gè)上調(diào)基因和41個(gè)下調(diào)基因可能與牛卵泡發(fā)育直接相關(guān)[4]。牛卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵泡發(fā)育出現(xiàn)偏差(Deviation)被認(rèn)為是卵泡發(fā)育的重要生理階段和轉(zhuǎn)折點(diǎn)，其中ODF1卵泡將發(fā)育為DF，具有排卵的潛力，而PDF2卵泡可能發(fā)育為SF，并最終走向閉鎖，本研究以牛卵巢PDF2和ODF1不同生理階段卵泡作為樣本篩選卵泡發(fā)育相關(guān)基因，隨機(jī)選擇差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證分析其在DF和SF中的表達(dá)譜，提高了卵泡發(fā)育基因篩選的準(zhǔn)確性，為深入研究基因調(diào)控牛卵泡發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選擇9頭正常發(fā)情的青年母牛，G6G技術(shù)(雙排卵同期發(fā)情技術(shù)的改進(jìn)方案，即注射PGF后,18～24 h補(bǔ)加1次)同期發(fā)情，每天兩次B超檢測(cè)，并實(shí)時(shí)記錄卵泡直徑變化。分別在卵泡發(fā)育波出現(xiàn)偏差前和偏差后，3頭牛分離ODF1卵泡，3頭牛分離PDF2卵泡，另3頭牛分離DF和SF。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的抽提 將分離的各卵泡分別置于預(yù)盛DPBS的平皿上，眼科剪一分為二后刮取GCs，移液槍轉(zhuǎn)移到EP管中，2 000 r·min-1離心15 min，棄上清，并加入10倍體積RNAiso Plus，抽提總RNA。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法詳見(jiàn)課題組前期研究[4-5]，Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行混合測(cè)序。

1.2.3 差異表達(dá)基因篩選 轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)基因的篩選參照S.Audic等[6]的研究方法，設(shè)定條件：RPKM值≥0.5，PDF2-RPKM 與ODF1-RPKM 雙向比值 ≥2，經(jīng)FDR校正(P<0.05)，獲得差異表達(dá)基因。

1.2.4 差異表達(dá)基因GO分析 應(yīng)用DAVID 6.7在線分析軟件(https://david.ncifcrf.gov/)輸入差異表達(dá)基因列表，物種選擇牛在線分析差異表達(dá)基因的功能聚類(Pvalue<0.05)并作圖。

1.2.5 卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選 差異表達(dá)基因經(jīng)GO功能富集分析后，結(jié)合Genecards(http://www.genecards.org/)基因功能在線查詢系統(tǒng)篩選，并獲得與牛卵泡發(fā)育直接相關(guān)的基因。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證分析 從篩選出的卵泡發(fā)育相關(guān)基因中，隨機(jī)選擇5個(gè)基因，利用qRT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜驗(yàn)證分析。qRT-PCR研究中，DF和SF顆粒細(xì)胞總RNA均為實(shí)驗(yàn)室前期獲得，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O(shè)計(jì)參考NCBI已提交的牛(Bostaurus)相關(guān)基因序列，RPLP0作為內(nèi)參基因，Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并送TaKaRa公司合成引物(表1)。

表1 熒光定量PCR引物序列

Table 1 Primers sequence of quantitative PCR

基因類型Genotype基因名稱Genesymbol引物序列(5'-3')Primersequence目的基因TargetgeneMAPK13F:GGAAGCAGCACATCTACAAGGA,R:TGGTAGGTGGTATCACGAGGCCYP19A1F:AGTCCTTCCTCGTGCTGAGTCCC,R:TCCTCCACTCGCCTTTCCTCCGREB1F:GTTCAATCGCGGATTCCAGC,R:ACCCCTGAATGCCAGACATGSERPINE2F:ACAAGGCCATCGTCTCCAAG,R:TTGTTCCTCGTGACGAAGGGGSTA5F:CAACAAGCTGAGCAAGGCTG,R:TTTCAGGCCCTTCAGCAGAG內(nèi)參基因ReferencegeneRPLP0F:CAACCCTGAAGTGCTTGACAT,R:AGGCAGATGGATCAGCCA

1.3 數(shù)據(jù)分析

各基因相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCT法計(jì)算，表達(dá)量數(shù)值經(jīng)內(nèi)參基因RPLP0校正，結(jié)果采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 PDF2和ODF1轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的篩選

Illumina平臺(tái)測(cè)序結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共獲得35 325個(gè)基因；設(shè)定參數(shù)RPKM值≥0.5的表達(dá)基因共15 413個(gè)，其中表2列出了15個(gè)高表達(dá)基因，由表2可知，這些高表達(dá)基因中有參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的RN5-8S1，也有參與細(xì)胞發(fā)育和內(nèi)分泌激素調(diào)控的基因，如INHA、INHBA和FST，這些基因在PDF2和ODF1中的表達(dá)量變化差異較小。

RPKM值≥0.5的表達(dá)基因經(jīng)FDR(P<0.05)校正后，設(shè)定PDF2-RPKM/ODF1-RPKM≥2，共獲得383個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因；設(shè)定ODF1-RPKM/PDF2-RPKM≥2，共獲得268個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因。其中差異表達(dá)倍數(shù)最高的20個(gè)基因及其功能注釋見(jiàn)表3。

表2 轉(zhuǎn)錄組PDF2和ODF1中15個(gè)表達(dá)量最高的基因

Table 2 Top 15 highly expressed genes in PDF2 and ODF1 follicles

基因名稱GenesymbolPDF2-RPKMODF1-RPKMGlutathioneS-transferasealpha3(GSTA3)12815.5417611.445.8SribosomalRNA(RN5-8S1)12506.60856.09Serglycin(SRGN)9501.337315.53HypotheticalLOC100337434(LOC100337434)7955.303115.13Serpinpeptidaseinhibitor,cladeE,member2(SERPINE2)7124.7011075.44Inhibin,alpha(INHA)6858.789658.83HypotheticalproteinLOC100336997(LOC100336997)6536.212262.25Inhibin,betaA(INHBA)6115.109440.2418SribosomalRNA(RN18S1)5947.281040.31CytochromeCoxidasesubunitI-like(LOC100299681)4322.933707.56Follistatin(FST)3968.984998.09CytochromecoxidasesubunitI-like(LOC100301020)2830.212372.11CytochromecoxidasesubunitI-like(LOC100300995)2800.572440.52Vimentin(VIM)2350.982050.73Milkfatglobule-EGFfactor8protein(MFGE8)2174.092077.70

表3 轉(zhuǎn)錄組PDF2和ODF1中10個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)最高的上調(diào)和下調(diào)基因及其功能

Table 3 Top 10 up-regulated and down-regulated genes with high differential expression fold in PDF2 and ODF1 and their functions

基因名稱GenesymbolPDF2-RPKMODF1-RPKMPDF2/ODF1ODF1/PDF2P值P-value基因功能GenefunctionLOC78780342.282.1519.65-2.56×10-3-PPP1R14A62.533.9915.67-調(diào)節(jié)磷酸化作用和平滑肌收縮OLA127.111.7415.59-水解ATP和GTPRN5-8S112506.60856.0914.61-1.74×10-2非編碼RNALOC1003373027.650.5913.04-6.82×10-3-QRFPR19.141.5512.32-4.77×10-4調(diào)節(jié)和苷酸環(huán)化酶活性和胞內(nèi)Ca2+水平RMRP167.0013.5712.31-線粒體RNA組分,參與核糖核蛋白修飾LOC6183604.960.549.22-1.98×10-5-VNN154.537.267.51-3.33×10-4參與造血細(xì)胞遷移ANGPT254.477.916.88-7.25×10-4調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡GAPDH1.4259.65-42.022.10×10-3參與葡萄糖代謝和新陳代謝BOLA-N8.76174.88-19.974.53×10-3MHCI類抗原TNFAIP63.3846.61-13.79調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定和細(xì)胞移行DDX460.678.83-13.224.83×10-3參與胚胎、精子發(fā)生和細(xì)胞生長(zhǎng)分化LOC50567611.50111.19-9.676.34×10-5CSDC21.3111.07-8.488.77×10-8負(fù)調(diào)控組蛋白合成LOC7854620.776.09-7.88CYP17A10.624.77-7.713.76×10-4參與雌激素、膽固醇和肽類合成LOC10012591611.2583.88-7.452.88×10-3ULBP31.017.46-7.405.46×10-3激活ERK、PI3K和Akt信號(hào)通路

2.2 PDF2和ODF1轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因GO分析

利用DAVID 6.7在線分析軟件對(duì)651個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)(Fold change)≥2的基因進(jìn)行GO富集性分析，共有484個(gè)基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中牛基因功能聚類數(shù)據(jù)相匹配，分為3大類111組：其中BP占41.66%，MF占17.24%，CC占41.10%(圖1)。經(jīng)GO分析對(duì)基因歸類注釋后，便于篩選與牛卵泡發(fā)育相關(guān)的基因。如CHGA、SYTL4、NDUFAF2負(fù)調(diào)控胰島素的分泌，而胰島素對(duì)牛卵泡GCs增殖和雌激素分泌具有重要影響；參與細(xì)胞發(fā)育和周期調(diào)控的基因有45個(gè)，通過(guò)蛋白磷酸化參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控基因有19個(gè)(圖1A)；調(diào)控跨膜受體蛋白激酶活性的基因有EPHA4、NTRK1、TGFBR3、KIT和EPHA2，CAV1、CTSH、FN1和PCOLCE2 4個(gè)基因參與肽酶催化活性的調(diào)節(jié)(圖1B)；參與蛋白復(fù)合體組分的基因有92個(gè)，參與DNA包裝復(fù)合體組分的基因有8個(gè)(圖1C)。

2.3 牛卵泡發(fā)育高度相關(guān)基因的篩選

經(jīng)GO功能聚類分析后，結(jié)合Genecards人基因功能注釋查詢，共獲得13個(gè)下調(diào)基因與牛卵泡發(fā)育直接相關(guān)，分別為MAPK13、GSTA5、SAFB2、WNT2B、EGR1、CHGA、KANK1、SESN3、PRICKLE1、ARID4B、TGFBR3、HBEGF和MAP2K6；獲得17個(gè)與牛卵泡發(fā)育直接相關(guān)的上調(diào)基因，分別為CYP19A1、GREB1、SERPINE2、IGF2、NOTCH1、CYP17A1、SOCS3、LHCGR、SIX5、STK11、SYTL4、DACT1、CEBPB、COL3A1、NTRK1、DEPTOR和MYC，其表達(dá)差異倍數(shù)及功能注釋見(jiàn)表4。

2.4 qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證

從表4中隨機(jī)選擇MAPK13、CYP19A1、GREB1、SERPINE2和GSTA5共5個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量驗(yàn)證分析，由圖2可知，CYP19A1、GREB1和SERPINE2在DF中的表達(dá)量極顯著高于SF(P<0.01)；MAPK13在SF中的表達(dá)量極顯著高于DF(P<0.01)，GSTA5在SF中的表達(dá)量顯著高于DF(P<0.05)。qRT-PCR分析結(jié)果表明，各基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符，表明PDF2和ODF1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可信度較高。

3 討 論

高通量測(cè)序技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組分析強(qiáng)有力的工具，在動(dòng)物卵泡發(fā)育和成熟研究中已有大量報(bào)道[7-9]。通過(guò)全基因轉(zhuǎn)錄組分析，大量差異表達(dá)基因編碼的信號(hào)分子如GDF9、BAX、BAD,NDUFA13、IFI6和CAV1與綿羊的多產(chǎn)性能密切相關(guān)[10]；對(duì)牛卵泡發(fā)育過(guò)程中黃體生成素波峰前及波峰后的卵泡GCs轉(zhuǎn)錄組分析表明，調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)基因的高表達(dá)對(duì)母牛排卵具有重要意義[8]，黃體生成素波峰后一組基因表達(dá)上調(diào)，對(duì)GCs黃體化發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。上述研究也表明，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序是篩選關(guān)鍵調(diào)控基因的有效途徑[12]；同時(shí)，Illumina測(cè)序技術(shù)誤差小，重復(fù)性也較好[13]。因此，本研究通過(guò)Illumina平臺(tái)對(duì)牛卵泡發(fā)育波中PDF2和ODF1卵泡進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，設(shè)定參數(shù)RPKM值≥0.5和表達(dá)差異倍數(shù)≥2，篩選差異表達(dá)基因，經(jīng)GO富集性分析，F(xiàn)DR校正(P<0.05)后，共獲得13個(gè)下調(diào)基因和17個(gè)上調(diào)基因與牛卵泡發(fā)育直接相關(guān)，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證分析。

圖1 差異表達(dá)基因GO分析Fig.1 GO analysis of differentially expressed genes

表4 牛卵泡發(fā)育相關(guān)基因

Table 4 The genes associated with bovine follicular development

基因名稱GenesymbolPDF2-RPKMODF1-RPKMPDF2/ODF1ODF1/PDF2基因功能GenefunctionMAPK131.550.612.54-參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育GSTA5149.4674.362.01-參與類固醇激素的合成SAFB24.421.064.17-調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和分化WNT2B1.120.512.19-調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化EGR16.402.412.65-參與細(xì)胞分化和有絲分裂CHGA1.930.952.02-經(jīng)cAMP-PKA-SP1上調(diào)蛋白酶KANK112.825.922.16-跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)活性SESN33.671.732.11-參與激素應(yīng)答PRICKLE12.331.112.09-負(fù)調(diào)控細(xì)胞分化ARID4B7.722.403.21-參與雄性性征分化TGFBR312.052.075.83-參與生長(zhǎng)因子應(yīng)答HBEGF1.490.542.76-正調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)MAP2K63.411.093.12-經(jīng)蛋白質(zhì)磷酸化參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)CYP19A1581.481944.89-3.34參與雌激素、膽固醇和肽類合成GREB156.04147.95-2.64參與雌激素刺激的細(xì)胞增殖過(guò)程SERPINE24879.0511075.44-2.27絲氨酸蛋白酶抑制劑活性IGF21.966.08-3.10調(diào)節(jié)胰島素分泌,參與胎兒發(fā)育NOTCH11.5510.50-6.76參與細(xì)胞和組織的發(fā)育CYP17A10.624.77-7.71孕酮合成通路的關(guān)鍵酶SOCS31.663.42-2.06調(diào)節(jié)胎盤(pán)發(fā)育LHCGR4.9115.05-3.06誘導(dǎo)第二性征發(fā)育SIX51.445.33-3.69參與器官發(fā)生STK111.092.31-2.11PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白SYTL41.092.35-2.16調(diào)節(jié)胰腺和腦垂體分泌DACT13.217.05-2.20調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路CEBPB3.036.96-2.30調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化COL3A13.8113.42-3.52轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)通路NTRK15.8816.67-2.84負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖DEPTOR1.863.80-2.05負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)MYC10.2823.54-2.29調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化

**. P<0.01;*.P<0.05.A. MAPK13;B.CYP19A1;C.GREB1;D.SERPINE2;E.GSTA5圖2 qRT-PCR表達(dá)量驗(yàn)證分析Fig.2 Real time PCR expression validation analysis

MAPK13的相關(guān)研究較少，近年來(lái)，作為疾病特異性藥物靶蛋白開(kāi)始被人們關(guān)注，在體內(nèi)表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性，因此，對(duì)其功能的研究受到了限制[14-15]。這種受限制的表達(dá)模式表明該激酶可能以特定的生物學(xué)通路作為靶目標(biāo)，如MAPK13調(diào)節(jié)胰島素分泌和胰島β細(xì)胞存活[16]。SAFB有SAFB1和SAFB2兩種形式，調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡[17]。研究表明，小鼠缺失SAFB1會(huì)導(dǎo)致IGF-1水平降低進(jìn)而影響小鼠生長(zhǎng)，通過(guò)降低雌二醇和黃體酮水平影響雌鼠生殖能力[18]；反之，SAFB1過(guò)表達(dá)會(huì)使細(xì)胞周期S期變短，從而加速細(xì)胞凋亡[19]。EGR1是雌激素誘導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)基因，以核磷蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡[20-21]，同時(shí)EGR1調(diào)節(jié)信號(hào)對(duì)雌性生殖器官發(fā)育具有重要作用[22]。PRICKLE最初以平面細(xì)胞極性調(diào)控蛋白被識(shí)別[23]，對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，PRICKLE1主要在發(fā)育胚胎的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)[24]，基因敲除試驗(yàn)表明，PRICKLE1對(duì)外胚層和基底外側(cè)極性的維持和建立具有重要作用[25]。ARID4B屬于ARID家族，包含一個(gè)DNA連接活性區(qū)域螺旋-折疊-螺旋結(jié)構(gòu)以及Tudor區(qū)域(TD)和chromo區(qū)域(CD)[26]，TD和CD區(qū)域作為分子適配區(qū)域連接甲基化組蛋白，促進(jìn)染色體重塑復(fù)合體的裝配[27]。TGFB生長(zhǎng)因子及其受體家族廣泛參與細(xì)胞進(jìn)程，包括增殖、遷移和分化，受體家族包括TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3，對(duì)其功能研究多集中在心血管發(fā)育及其疾病調(diào)控方面[28]。

CYP19A1和CYP17A1是細(xì)胞色素P450 超家族蛋白之一，參與類固醇激素的生物合成并在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究表明，CYP19A1受到多重通路調(diào)控，包括GCs中雌激素受體以及FSH受體激活的cAMP/蛋白激酶A通路，這些通路可能決定了牛卵泡的優(yōu)勢(shì)化[29]。SERPINE2在牛卵泡發(fā)育波出現(xiàn)偏差前和偏差后卵泡GCs中均大量表達(dá)，提示SERPINE2對(duì)牛卵泡發(fā)育具有重要作用[4]。雌激素分泌和SERPINE2極顯著相關(guān)，但雌激素處理體外培養(yǎng)的GCs不會(huì)改變SERPINE2的表達(dá)，F(xiàn)SH和生長(zhǎng)因子可直接影響SERPINE2的分泌；SERPINE2屬于抗凋亡因子，可能參與了牛卵泡閉鎖的調(diào)控[30]。GREB1被證明是一種與染色質(zhì)結(jié)合的雌激素受體共激活體，對(duì)雌激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，因?yàn)樗€(wěn)定了雌激素受體和其他輔助因子之間的相互作用；GREB1參與雌激素與其受體的結(jié)合，因此，GREB1也是一種潛在的臨床生物標(biāo)志物[31]。

4 結(jié) 論

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因篩選，共獲得13個(gè)下調(diào)基因和17個(gè)上調(diào)基因與牛卵泡發(fā)育緊密相關(guān)，qRT-PCR表達(dá)量驗(yàn)證分析表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可信度較高。

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