牦牛Cyclin D1基因的克隆及IGF-I對其在睪丸支持細胞表達的影響

王亞營，潘陽陽，葉小琳，李谷月，何翃閎，王 萌，樊江峰，崔 燕，余四九

(甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

牦牛是能夠適應高寒低氧環境的珍稀物種，主要分布在我國青藏高原海拔3 000 m以上的地區，具有重要的經濟價值，但其自然繁殖率低，限制了牧區的發展。在牦牛上應用輔助生殖技術(Assisted reproductive technology，ART)是提高其繁殖率的重要手段，而雄性牦牛提供高質量的精子是體外繁殖成功的前提。睪丸支持細胞(Sertoli cell，SC)是唯一與生精細胞(Germ cell，GC)直接接觸的體細胞，其共同構成睪丸曲細精管。睪丸支持細胞結構上緊密相連構成了血-睪屏障(Blood-testis barrier，BTB)，為生殖細胞的發育提供獨特的微環境[1]。睪丸支持細胞產生一系列蛋白質來調控垂體激素的釋放，從而影響生殖細胞減數分裂的活性并促進精子的釋放[2]，對生精過程起到至關重要的調控作用。成年雄性動物睪丸的大小、生殖細胞的數量以及精子質量與SC的數量直接相關[3]。

細胞周期蛋白(Cyclins)是調控細胞周期進程的一系列蛋白質。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)高表達于細胞G1期，與細胞周期蛋白依賴性激酶4和6(Cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6)結合，形成Cyclin D1-CDK4/CDK6復合物，之后與磷酸化的視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylation retinoblastoma protein，pRb)結合，使細胞由G1期進入S期，促進細胞周期進程。G1/S是細胞周期中重要的時間點，其決定細胞是否進行分裂增殖[4-5]。研究表明，Cyclin D1促進睪丸間質細胞的增殖并抑制其凋亡[6]。將小鼠胚胎干細胞中CyclinD1基因的部分外顯子用非編碼序列替換，得到缺乏Cyclin D1蛋白的突變鼠，其在發育過程中表現出生殖障礙等多種癥狀[7]。胰島素樣生長因子-I(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)是一種促生長因子，對生殖器官的功能起到重要的調控作用。IGF-I通過調控Bax和Bcl-2等凋亡相關基因，降低了卵丘細胞[8]、卵母細胞[9]和睪丸間質細胞[10]等的凋亡率，同時還提高精子在低溫環境中的運動能力及冷凍復蘇的活性[9,11]。IGF-I顯著提高牦牛凍精活性和體外授精胚胎的囊胚產量，并且降低了囊胚中細胞凋亡比率[12-13]。缺乏胰島素受體(Insulin Receptor，InsR)和胰島素樣生長因子受體(Insulin-like growth factor Receptor，IGFR)的小鼠，睪丸支持細胞增殖率降低，從而導致精子產量降低，成年后睪丸的尺寸比正常鼠小75%[14]。IGF-I在維持與生殖相關細胞的正常生理功能方面發揮著重要作用，然而IGF-I是否調控睪丸支持細胞中周期相關蛋白的表達尚不清楚，牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息學分析在國內外也尚未見報道。

本研究以牦牛睪丸支持細胞為研究對象，克隆牦牛CyclinD1基因的CDS序列，并對其進行生物信息學分析；同時研究IGF-I對Cyclin D1在睪丸支持細胞中表達的影響。研究結果將為調控睪丸支持細胞的發育提供試驗依據，為探索精子發生機制和提高精子質量奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

細胞培養箱(Thermo，美國)、PCR 儀(Rio-Rad，美國)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)、倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；DMEM/F-12、胎牛血清(Fetal Bovine serum，FBS)(Gibco)；胰蛋白酶、膠原蛋白酶、透明質酸酶、IGF-I(Sigma)；總RNA提取試劑盒(Omega)；反轉錄試劑盒、GoTaq Green Master Mix(Promega)；膠回收試劑盒(GenStar)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、pMD 18-T Vector(TaKaRa)；Fasl多克隆兔抗、CyclinD1多克隆兔抗以及羊抗兔多克隆抗體(博奧森)。

1.2 樣品采集及細胞培養與鑒定

2016年10月在青海省西寧市樂家灣屠宰場，采取健康5～8月齡(此階段為牛睪丸支持細胞的增殖分化期)牦牛的睪丸樣品。獲得樣品后，將其放入生理鹽水(含雙抗)中，再置于冰盒密封，4 h內送到實驗室，并對其進行處理。牦牛睪丸支持細胞的體外分離培養與鑒定參考M.D.Anway等[15]和H.Zhang等[16]的操作方法，采用兩次酶消化法獲得睪丸支持細胞，20 mmol·L-1Tris-Hcl低滲處理和饑餓培養以純化細胞，再用含10% FBS的培養液培養細胞，細胞生長至80%以上融合時，用0.25%的胰酶消化細胞，調整細胞密度為5×104·mL-1，爬片培養48 h，采用Fasl免疫細胞化學方法鑒定細胞。

1.3 引物設計

根據GenBank中牛(Bostaurus)的CyclinD1和β-actin序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計牦牛的CDS序列擴增引物Cyclin D1-C、熒光定量檢測引物Cyclin D1-Y和β-actin內參引物。引物序列送上海華大基因科技公司合成。引物序列詳見表1。

表1 目的基因和內參基因引物序列

Table 1 Primer sequences of target and reference genes

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductsize退火溫度/℃TmCyclinD1-CF:CCCAACCATGGCACACCR:CCCAACCATGGCACACC100960CyclinD1-YF:CGGTGTCCTACTTCAAGTGTGTGR:GACAGGAAGCGGTCCAGGTA14860β-actinF:AGGCTGTGCTGTCCCTGTATGR:GCTCGGCTGTGGTGGTAAA20058

1.4 牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息學分析

當原代SC生長至80%以上融合時，提取細胞總的RNA，再反轉錄成cDNA，置于冰箱-20 ℃，保存備用。以cDNA為模板， Cyclin D1-C為引物進行PCR擴增。反應體系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，GoTaq Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃ 5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，對目的條帶進行膠回收，將純化后的DNA與pMD 18-T Vector 載體連接，轉染到JM109感受態細胞，培養獲得的菌液，送至上海生工生物工程公司進行測序。測序完成之后，將結果進行拼接，并對其進行生物信息學分析。利用NCBI在線軟件Open reading frame finder(ORF Finder)對基因進行開放閱讀框(Open reading frame，ORF)分析；利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統進化樹；利用 DNAMAN對核苷酸和氨基酸的同源性進行分析。

1.5 細胞免疫熒光法對蛋白質表達進行定位

選取純化后的牦牛SC，將細胞密度調整為5×104·mL-1進行細胞爬片。培養48 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，置于冰箱，4 ℃過夜；0.5%Tritonx-100透化1 h；1%BSA溶液室溫封閉2 h；CyclinD1抗體稀釋液(1∶100)孵育細胞，冰箱4 ℃過夜；二抗稀釋液(1∶100)孵育細胞，室溫2 h；5 ng·mL-1的DAPI染細胞核3 min；置于倒置熒光顯微鏡下拍照。每個步驟之間用PBS將玻片洗凈，且二抗孵育后應避光操作。

1.6 qRT-PCR檢測CyclinD1基因表達

選取純化后的牦牛SC，以1×105·mL-1的細胞密度接種于6孔板中，每孔接種2 mL細胞懸液，培養24 h(使細胞全部處于靜止期)后，加入IGF-I，使其終濃度分別為0、25、50、100、150 ng·mL-1，每個濃度3個重復，24 h后提取細胞總RNA。IGF-I作用時間根據牦牛睪丸支持細胞分裂周期選取[16]。反轉錄后，將cDNA濃度調至200 ng·μL-1，通過qRT-PCR檢測CyclinD1 mRNA的表達。反應體系：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，共20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s，共40個循環。

1.7 Western blotting檢測CyclinD1蛋白表達

細胞培養及因子作用等與1.6中相同，提取細胞總蛋白。獲得的蛋白質樣品與蛋白上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，置于100 ℃溫箱中，煮10 min，使蛋白質充分變性；變性后的蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離；在300 mA恒定電流條件下，將凝膠上的目的蛋白轉到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉溶液，將膜封閉2 h；Cyclin D1抗體4 ℃孵育過夜；二抗常溫孵育2 h；加電化學發光顯色液(Electrochemi- luminescence, ECL)避光顯色，X光片曝光，掃描蛋白條帶。

1.8 數據分析

2 結 果

2.1 牦牛睪丸支持細胞培養與鑒定

純化培養獲得原代牦牛SC(圖1 A)和三代SC(圖1 B)，均生長良好。Fasl免疫細胞化學法顯示，Fasl蛋白在該細胞表達呈陽性(圖1 C)，陰性對照不表達(圖1 D)，由此可確定試驗所用為純度較高的牦牛睪丸支持細胞。

A. 原代SC； B. 三代SC；C. Fasl陽性表達；D.陰性對照A. The first generation of SC；B. The third generation of SC；C. Positive staining for Fasl；D. Negative control圖1 牦牛睪丸支持細胞的培養和鑒定(標尺：100 μm)Fig.1 The cultivation and identification of the yak Sertoli cells (Scale bar: 100 μm)

2.2 CyclinD1基因的克隆及生物信息學分析

Cyclin D1-C進行RT-PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳顯示，預期位置有明顯熒光條帶(圖 2)。利用NCBI在線軟件BLAST對拼接后的序列進行比對，Cyclin D1-C擴增產物序列與牛的CyclinD1(NM_001046273.2)序列為99%相似。將牦牛CyclinD1序列提交至GenBank，登錄號為KY 420723。

ORF分析表明，該基因編碼區長888 bp，起始密碼子在8 bp處，終止密碼子在895 bp處，編碼295個氨基酸。系統進化樹結果顯示(圖3)，牦牛CyclinD1基因與瘤牛、黃牛和水牛的親緣關系最近，與山羊和綿羊次之，與人和貓的親緣關系最遠。同源性分析結果表明(表2)：牦牛Cyclin D1核苷酸序列同源性與黃牛和瘤牛的最高，為99.9%；與人的最低，為92.2%。牦牛Cyclin D1氨基酸序列同源性與黃牛、瘤牛和水牛的同源性均為100%，與人的同源性為93.5%。

M. DL2000 DNA分子質量標準；1～2. Cyclin D1 基因擴增產物M. DL2000 DNA marker; 1-2. Cyclin D1 RT-PCR products圖2 牦牛Cyclin D1基因的RT-PCR產物電泳結果Fig.2 Agarose gels electrophoresis results of Cyclin D1 RT-PCR products

圖3 Cyclin D1 基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cyclin D1

2.3 Cyclin D1蛋白在SC中的分布與定位

細胞免疫熒光顯示(圖4)，Cyclin D1蛋白在SC胞核上高表達，部分細胞核中呈強表達，在SC胞質上呈極微弱表達。

表2 牦牛和不同物種間CyclinD1基因序列和氨基酸序列同源性比較

Table 2 Homologous comparisons of nucleotide and amino acids sequences of yakCyclinD1 gene with that of other species %

A. Cyclin D1；B. DAPI；C.合成A. Cyclin D1；B. DAPI；C. Merge圖4 牦牛SC Cyclin D1蛋白表達免疫熒光技術檢測(標尺：100 μm)Fig.4 The detection of Cyclin D1 protein on yak SC by immunofluorescence method (Scale bar: 100 μm)

2.4 IGF-I對牦牛SC 中Cyclin D1 mRNA的調節

IGF-I作用于體外培養的SC，對獲得的樣品進行qRT-PCR分析，結果顯示(圖5)：IGF-I濃度為25和150 ng·mL-1時，CyclinD1 mRNA表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)，前者表現促進，后者表現抑制；IGF-I濃度為50和100 ng·mL-1時，CyclinD1 mRNA表達量顯著高于其他各組(P<0.05)，其中50 ng·mL-1組的表達量最高，為對照組的1.65倍。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant difference (P<0.05); same letter means no significant difference (P>0.05). The same as below圖5 不同濃度IGF-I對Cyclin D1 mRNA表達的影響Fig.5 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 mRNA expression

2.5 IGF-I對牦牛SC 中Cyclin D1 蛋白的調節

不同濃度IGF-I加入體外培養的SC，作用24 h，對獲得的蛋白樣品進行Western blotting，結果顯示(圖6和7)：與對照組相比， IGF-I作用組的Cyclin D1蛋白的表達量均有提高，IGF-I濃度為100 ng·mL-1組蛋白表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)，IGF-I濃度為25、50和150 ng·mL-1組蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)，其中，50 ng·mL-1組的蛋白表達量最高，為對照組的1.20倍。

1～5. 0、25、50、100、150 ng·mL-1 IGF-I1-5.0, 25, 50, 100, 150 ng·mL-1 IGF-I圖6 Cyclin D1和β-actin蛋白檢測Fig.6 The detection of Cyclin D1 and β-actin protein

圖7 不同濃度IGF-I對Cyclin D1蛋白表達的影響Fig.7 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 protein expression

3 討 論

本研究成功克隆出牦牛CyclinD1基因的CDS序列(GenBank登錄號：KY 420723)。生物信息學分析顯示，牛屬動物CyclinD1核酸序列同源性達到99%以上，氨基酸序列完全一致，與其他物種相比均有較高同源性，表明CyclinD1基因在進化過程中具有保守性。 Cyclin D1蛋白在細胞中呈周期性表達，于G1期表達量最高。異步生長的人成纖維細胞免疫熒光結果顯示， Cyclin D1蛋白在絕大多數細胞中呈陽性表達，且定位于細胞核[17]。本研究中，用于免疫熒光檢測的SC未做同步生長處理，其結果顯示，絕大多數細胞核中高表達Cyclin D1蛋白，這與前人的研究結果一致，但胞核中Cyclin D1的熒光強度并不同，可能由于細胞處于周期進程中的不同階段。

A. Dance等[18]通過細胞計數證明，IGF-I促進體外培養的牛SC數目增殖。本研究則從分子水平進行探究，分析不同濃度的IGF-I對牦牛睪丸支持細胞中Cyclin D1基因和蛋白表達的影響，結果顯示：添加IGF-I后，Cyclin D1基因和蛋白的表達量總體上升，且具有劑量依賴性，表明IGF-I可以通過調控Cyclin D1的表達，促進SC周期進程，引起細胞增殖；但高濃度的IGF-I可能激活了抑制Cyclin D1表達的途徑，在本研究中，IGF-I 為150 ng·mL-1時，試驗組CyclinD1 mRNA表達量低于對照組(P>0.05)，可能與PI3K介導的胰島素家族的負調控機制有關[19]。P.Ye等[20]研究發現，100 ng·mL-1的IGF-I作用于大鼠少突膠質細胞24 h，CyclinD1 mRNA表達量為對照組的7倍；Y. Jiang等[21]發現，100 ng·mL-1的IGF-I作用于鼠系膜細胞，Cyclin D1蛋白表達量為對照組的1.6倍。在本研究中，IGF-I 為100 ng·mL-1時，Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達量分別為對照組的1.21和1.05倍。IGF-I作用于細胞時，首先與細胞表面的受體相結合，激活下游分子。研究顯示，不同組織器官中IGF-I及其受體的含量[22-23]與活性[24]均不同。因此，以上差異可能與試驗對象在機體內的位置及功能有關，提示生長因子對生殖器官的調控可能存在特異性。本研究中Cyclin D1基因和蛋白表達呈現一定差異性，可能是由于Cyclin D1蛋白表達過程受到多條信號通路的調控。目前研究表明，Cyclin D1至少存在兩條轉錄后調控通路，即mTOR和/或PI3-p70S6通路和PI3 -eIF4E通路，它們可與Ras偶聯，對Cyclin D1進行蛋白翻譯水平的調控[25]。Ras是生長因子作用靶標，將刺激細胞生長的信號傳遞給下游分子，促進細胞周期進展[26]。同時，IGF-I還可以激活PI3K/Akt和MEK/ERK激酶途徑，調控Cyclin D1的表達[27]。因此，Cyclin D1在SC上的表達可能受到多方面的調控。

雄性動物成年后， SC在體內不再進行增殖分化，雄性動物的生精質量在其成年之前就已決定[3]。SC的成熟障礙是多數雄性生殖障礙的根本原因，且SC的成熟障礙可能在出生之前就已經存在[28-29]?？偨Y本研究及前人成果發現，IGF-I上調牦牛SC中Cyclin D1蛋白的表達，同時還可抑制多種生殖相關細胞的凋亡。因此，IGF-I可能通過促進牦牛SC周期進程，抑制其凋亡，從而促進SC的增殖和成熟，使其數量和質量維持正常。這對提高牦牛的生精能力及精子質量具有重要意義。

4 結 論

本研究成功克隆牦牛CyclinD1基因(GenBank登錄號：KY 420723)，生物信息學分析顯示，其在進化過程中高度保守，Cyclin D1蛋白主要在SC胞核表達。IGF-I上調SC中Cyclin D1基因和蛋白的表達，具有劑量依賴性，最佳作用濃度為50 ng·mL-1。IGF-I可以通過影響SC中Cyclin D1的表達調控睪丸發育，從而影響雄性胚胎的生殖發育和成年動物的精子質量。

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