羥基蛋氨酸鋅對斷奶仔豬鎘損傷的修復作用

劉粉粉，倪姮佳*，黃 攀，吳 信，張 彬，張維軍，姚亞軍，印遇龍1，

(1. 湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128； 2. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所，中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，農業部中南動物營養與飼料科學觀測實驗站，長沙 410125；3. 中國科學院大學，北京 100049; 4. 長沙興嘉生物工程股份有限公司，長沙 410001)

鎘(Cadmium，Cd)是自然界存在的天然成分，但是隨著在工業和生活中的應用，其在水體和土壤中的含量逐漸增加，其廣泛的存在性、強蓄積性和臟器毒性已對人體和畜禽的健康形成了重大的安全隱患[1]。我國飼料衛生標準(GB13078-2001)規定豬、雞配合飼料中鎘濃度不得高于0.5 mg·kg-1。然而在鎘污染地區，部分飼料原料中的鎘含量遠超這個數值[2]。腸道上皮細胞是鎘攻擊機體的第一道靶點，肝和腎是鎘中毒的主要靶點器官[3]。鎘可通過多種機制擾亂組織內穩態，首先通過破壞腸道上皮屏障和其緊密連接結構的變化導致腸道結構和功能損傷[4]。鎘的肝損傷主要是由于鎘通過與肝抗氧化酶中的金屬輔基發生競爭性替換，抑制這些酶的活性，造成肝自由基清除能力下降，導致細胞發生脂質過氧化反應和氧化應激[5]。腎鎘的蓄積會損傷腎的濾過和重吸收功能[6]。鋅和鎘屬于同族元素，二者的化學性質相似，均以二價陽離子形式存在于生物體內。體內必需金屬離子鋅離子的含量能夠影響鎘離子的生物學效應[7]。但是飼料中的植酸類物質易與鋅形成動物機體不能吸收的螯合物[8]，導致無機鋅的利用效率降低。羥基蛋氨酸螯(絡)合鋅(Methionine hydroxy analog chelated zinc，MHZn)是以1個羥基蛋氨酸分子與1～2個鋅原子絡合而成的化合物。因為絡合物較穩定，能避免腸腔中拮抗因子及其它影響因素對Zn的沉淀和吸附[9]，促使更多的Zn到達腸道的吸收位點，從而被機體高效吸收和利用。另外，MHZn可在體內轉化為蛋氨酸[10]，研究表明蛋氨酸能預防和治療重金屬鎘對機體的傷害[11-12]。因此，MHZn不僅具有雙重營養的功效，其在緩解鎘毒性方面也具有潛在的價值。

本研究利用45日齡仔豬建立鎘暴露模型，研究MHZn對鎘暴露造成的組織損傷的保護作用及機制，為高效緩解或保護鎘暴露造成的機體損傷，以及高效利用微量元素提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無水氯化鎘(純度99.99%，阿拉丁試劑有限公司)、羥基蛋氨酸鋅(含鋅12%)由長沙興嘉生物工程股份有限公司提供。蘇木精、伊紅染料購自南京雨露實驗器材有限公司。所有的化學試劑均為分析純。

1.2 動物和日糧

試驗選用24頭45日齡的長×大閹公豬，具有相似的初始體重(13.22±1.36) kg，經7 d的適應飼養后，隨機分為4個處理組，每個處理組6個重復，每個重復1頭豬，單欄飼喂。4個試驗組分別為對照組(Con組)、含鎘日糧組(30 mg·kg-1，Cd組)、鎘(30 mg·kg-1)+ 低濃度羥基蛋氨酸鋅(100 mg·kg-1)日糧組(LMHZn組)、鎘(30 mg·kg-1)+ 高濃度羥基蛋氨酸鋅(200 mg·kg-1)日糧組(HMHZn組)。試驗期間自由采食和飲水，共30 d。基礎日糧參照NRC配合而成，其組成及營養水平見表1。

1.3 屠宰和樣品采集

試驗期間每天觀察豬生長情況，記錄飼料消耗情況，第31天清晨對豬進行空腹稱重, 計算仔豬平均日增重、日采食量、料重比，前腔靜脈采血5 mL，室溫靜置1～2 h，3 500 r·m-1離心10 min，取上清液1.5 mL置離心管內，-80 ℃低溫冰箱保存待測。屠宰、采樣，稱量肝、腎、脾重量，計算仔豬臟器系數；取十二指腸、空腸、回腸、肝、腎部分組織迅速放入4%多聚甲醛溶液，搖勻，用于病理切片檢測。其余儲存于-20 ℃用于其他指標的檢測。其中，料重比=平均日采食量(kg)/平均日增重(kg)；臟器系數=臟器重量(kg)/仔豬末重(kg)×100%。

表1 基礎日糧及營養水平

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet

%

1). 預混料為每千克飼糧提供：維生素A 17 809.4 IU；維生素D35 479.8 IU；維生素E 43.84 mg；維生素K310.96 mg；維生素B15.48 mg；維生素B213.70 mg;維生素B66.58 mg；維生素B1254.80 μg；煙酸/煙酰胺 54.80 mg；葉酸 2.74 mg；泛酸鈣 27.40 mg；生物素 328.79 μg；維生素C 109.60 mg；膽堿 1 643.94 mg；食鹽 2 959.09 mg；賴氨酸 5 476.79 mg；蛋氨酸 1 753.53 mg；蘇氨酸 2 191.92 mg；酸化劑1 973.73 mg；CuSO4·5H2O 328.79 mg; MnSO4·H2O 219.19 mg; ZnSO4·H2O 109.60 mg; 甘氨酸鐵 657.58 mg；1%碘21.92 mg；1%硒 21.92 mg；1%鈷 21.92 mg；肽生素 986.36 mg；統糠 6 970.30 mg；白糖 7 890.96 mg

1). Supplied per kilogram of finished feed: Vitamin A 17 809.4 IU; Vitamin D35 479.8 IU; Vitamin E 43.84 mg; Vitamin K310.96 mg; Vitamin B15.48 mg; Vitamin B213.70 mg; Vitamin B66.58 mg; Vitamin B1254.80 μg; Niacin/niacinamide 54.80 mg; Folic acid 2.74 mg; Calcium pantothenate 27.40 mg;Biotin 328.79 μg; Vitamin C 109.60 mg; Choline 1 643.94 mg; Salt 2 959.09 mg; Lysine 5 476.79 mg; Methionine 1 753.53 mg; Threonine 2 191.92 mg; Acidulant 1 973.73 mg;CuSO4·5H2O 328.79 mg; MnSO4·H2O 219.19 mg; ZnSO4·H2O 109.60 mg; Glycine iron 657.58 mg;1% iodine 21.92 mg;1% selenium 21.92 mg;1% cobalt 21.92 mg;Peptide raw 986.36 mg; Mixture of rice chaff and husk 6 970.30 mg; White sugar 7 890.96 mg

1.4 肝、腎、十二指腸、空腸、回腸組織切片的制作

將固定的組織樣經水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后, 在室溫下切成5 μm的切片，蘇木精-伊紅染色，用正置熒光顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯)觀察病理變化，測量各腸段的絨毛高度、隱窩深度。參照陳恒燦等[13]的方法處理和觀察小腸形態學變化，肝和腎病理學變化觀察參照R.E.Dudley等[14]的方法。

1.5 肝、腎中微量元素測定

-20 ℃環境中取出仔豬肝、腎，切取 0.5 g左右大小的組織塊，濾紙吸去表面水分，電子天平準確稱量重量后置于一錐形瓶中。向錐形瓶加入20 mL硝酸與高氯酸的混合液 (4∶1)，通風櫥內靜置過夜充分消化。低火緩慢加熱錐形瓶，直至瓶內變透明，液體完全被蒸發。用 1%的硝酸溶液重新溶解錐形瓶內剩余物，定容至 10 mL后可用于檢測。取少量的上樣液用電感耦合等離子光譜發生儀(720 ES，安捷倫)檢測其中各離子的含量。

1.6 血漿生化指標測定

用全自動生化分析儀(cobas c311)進行血漿生化指標的測定。測定內容：白蛋白(Albumin，ALB)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血肌酸酐(Creatinine，CREA)、血糖(Blood glucos，GLU)、磷(Phosphorus，P)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)、血氨(Blood ammonia，NH3L)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、總蛋白(Total protein，TP)、二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)。

1.7 數據處理

試驗數據采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)， 差異顯著時采用Duncan氏法進行組間多重比較，P<0.05為差異顯著，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬生長性能和臟器系數的影響

生長性能測定結果顯示(表2)，含鎘日糧顯著降低了仔豬的平均日增重(P<0.05)，提高了料重比(F/G)(P<0.05)。在含鎘日糧中添加MHZn時，仔豬日增重顯著升高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)，并與Con組無顯著差異(P>0.05)。

臟器系數檢測結果顯示(表2)，Cd組相較于Con組肝臟系數顯著增大(P<0.05)，當MHZn添加量為200 mg·kg-1時，仔豬肝臟系數顯著低于Cd組(P<0.05)，且接近Con組水平(P>0.05)，各處理組間腎臟系數、脾臟系數無顯著差異(P>0.05)。

表2 仔豬生長性能和臟器系數

Table 2 Growth performance and organ coefficients of piglets

項目Item對照組Con鎘Cd鎘+MHZn(低)LMHZn鎘+MHZn(高)HMHZn平均日增重/(kg·d-1)Averagedailygain0.67±0.08a0.54±0.05b0.64±0.05a0.64±0.05a平均日采食量/(kg·d-1)Averagedailyintake1.10±0.101.00±0.091.06±0.101.09±0.06料重比Feed-gainratio1.63±0.12a1.88±0.13b1.67±0.14a1.72±0.17a肝臟系數Livercoefficient2.35±0.17b2.73±0.13a2.56±0.13ab2.45±0.11b腎臟系數Kidneycoefficient0.45±0.060.41±0.020.43±0.030.45±0.03脾臟系數Spleencoefficient0.18±0.030.19±0.020.18±0.030.18±0.04

同行數據后所標字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Different letters in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05), same letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05). The same as below

2.2 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬組織病理損傷的影響

腸道組織病理學分析結果(圖1B、1F、1J)顯示，鎘能致十二指腸、空腸損傷，而對回腸的損害作用較小。圖2也表明，相較于Con組，Cd組十二指腸和空腸的絨毛長度顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著增高(P<0.05)，絨毛長度/隱窩深度比顯著降低(P<0.05)。LMHZn和HMHZn組相較于Cd組,

圖1 仔豬十二指腸、空腸、回腸、肝、腎病理學分析(100×)Fig.1 Histopathologic analysis of duodenum, jejunum, ileum, liver and kidney in piglets (100×)

圖2 仔豬小腸絨毛長度、隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度Fig.2 Villus length, crypt depth and the ratio of villus height/crypt depth of the small intestine of piglets

十二指腸和空腸絨毛長度顯著升高(P<0.05)，空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)。HMHZn組相較于Con組，十二指腸絨毛長度、隱窩深度，空腸隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度比無顯著差異(P>0.05)。

圖1M～1P顯示，Cd組仔豬肝細胞腫脹，胞內有空泡，并伴隨大范圍的顆粒變性和脂肪變性；在含鎘日糧中添加MHZn時，可有效緩解上述癥狀。圖1Q～1T顯示，Cd組仔豬的腎小管上皮細胞變性，細胞內可見固縮核；部分腎小管上皮細胞脫落至管腔，并伴有淋巴細胞增生；隨著MHZn添加濃度的升高，上述癥狀逐漸減輕。

2.3 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬肝、腎中鎘及其他微量元素含量的影響

肝中鎘和微量元素含量檢測結果顯示(表3)，Cd組鎘、錳含量顯著高于Con組(P<0.05)，鐵含量顯著低于Con組。在含鎘日糧中添加MHZn時，與 Cd組相比，LMHZn組與HMHZn組鎘、錳含量顯著降低(P<0.05)。

腎中鎘和微量元素含量檢測結果顯示(表3)，Cd組鎘、銅、鋅含量顯著高于Con組(P<0.05)，鐵含量顯著低于Con組(P<0.05)。在含鎘日糧中添加MHZn，相較于Cd組HMHZn組鎘含量顯著降低(P<0.05)。

2.4 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬血漿生化指標的影響

表4結果顯示，與Con組相比，Cd組血漿中ALB含量顯著降低(P<0.05)，TP含量呈下降趨勢(P>0.05)，DAO酶活呈上升趨勢(P>0.05)。與Cd組相比，LMHZn組和HMHZn組的ALB和TP有所回升，DAO酶活降低，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表3 仔豬肝、腎中鎘、銅、鐵、鎂、錳、鋅和鈣的含量

Table 3 Concentrations of cadmium, copper, iron, magnesium, manganese, zinc and calcium in liver and kidney of piglets

μg·g-1

3 討 論

仔豬鎘中毒會導致生長發育遲緩，J. Du等[15]研究表明，(17.25±0.07) kg的仔豬日糧中添加30.49 mg·kg-1的 CdCl2，飼喂29 d，仔豬平均日采食量顯著降低，料重比顯著增高。C.Phillips等[16]研究也發現，斷奶30 d的仔豬飼糧中以Cd(NO3)2·4H2O的形式添加2.50 mg·kg-1的鎘，3周后仔豬平均日增重，日采食量顯著降低。 本研究結果顯示，仔豬飼喂含鎘日糧后，平均日增重顯著降低(P<0.05)，料重比顯著升高(P<0.05)，表明鎘影響了仔豬的正常生長發育，這一結果與以往報道的一致[15-19]。在含鎘日糧中同時添加MHZn時，仔豬日增重顯著升高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)，并與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明MHZn可有效減少鎘對仔豬的生長抑制作用。

表4 仔豬血漿生化指標的測定結果

Table 4 Analysis of plasma biochemical parameters of piglets

項目Item對照組Con鎘Cd鎘+MH-Zn(低)LMHZn鎘+MH-Zn(高)HMHZn白蛋白/(g·L-1)ALB38.10±2.23a32.03±4.08b34.68±3.06ab35.20±4.24ab谷丙轉氨酶/(U·L-1)ALT55.03±8.4954.27±11.8353.72±13.6854.93±5.10谷草轉氨酶/(U·L-1)AST53.00±16.5784.00±61.1048.00±15.2455.67±10.29堿性磷酸酶/(U·L-1)ALP162.67±27.66191.83±33.27158.83±38.50186.00±35.03乳酸脫氫酶/(mmol·L-1)LDH713.67±163.70810.33±137.23790.00±124.76801.33±79.53血尿素氮/(mmol·L-1)BUN3.33±0.952.40±0.282.90±0.492.87±0.85血肌酸酐/(μmol·L-1)CREA77.50±9.5286.67±15.2487.00±4.6982.50±5.58血糖/(mmol·L-1)GLU3.90±0.804.08±1.524.67±1.044.12±1.54磷/(mmol·L-1)P3.61±0.203.39±0.383.59±0.193.47±0.19高密度脂蛋白/(mmol·L-1)HDL0.83±0.130.80±0.120.78±0.260.91±0.18低密度脂蛋白/(mmol·L-1)LDL1.15±0.131.15±0.191.21±0.211.23±0.26血氨/(μmol·L-1)NH3L264.60±98.84395.10±152.78303.03±72.23243.75±37.91免疫球蛋白M/(g·L-1)IgM0.67±0.120.76±0.120.81±0.170.67±0.21總蛋白/(g·L-1)TP59.77±1.63ab56.92±4.45b62.93±3.21a59.32±4.73ab二胺氧化酶/(U·mL-1)DAO2.12±0.34ab3.00±1.45a2.00±0.36ab1.86±0.75b

另外，本研究發現，含鎘日糧導致仔豬十二指腸和空腸的絨毛長度降低，十二指腸、空腸的隱窩深度增高、絨毛隱窩比減小，這一結果表明，鎘導致十二指腸和空腸絨毛上皮細胞的壞死速度超過了更新速度，使得腸道屏障功能受損[20-21]。而MHZn可顯著提高小腸絨毛高度(P<0.05)，降低隱窩深度(P<0.05)，表明MHZn可有效降低鎘導致的腸道損傷，有助于維護腸道健康。MHZn的這一功效可能與其分子中的鋅密切相關。研究表明，鋅具有保護腸黏膜屏障的功能[22-23]，在鎘暴露條件下補充鋅可通過減少腸道鎘吸收來降低機體的鎘負荷[24]。

肝、腎是鎘蓄積的主要器官。鎘在肝和腎的過量蓄積會導致組織損傷和細胞的凋亡與壞死[25-26]。韓新艷等研究發現，體重27 kg左右杜長大生長豬飼料中添加10.0 mg·kg-1的鎘使肝系數顯著提高，腎系數無顯著性變化[27]，本研究結果與之相符。本研究還發現，含鎘日糧在顯著提高仔豬肝鎘含量的同時，還導致肝細胞腫脹，胞內出現空泡，并伴隨大范圍的顆粒變性和脂肪變性等病理性損傷，表明肝已出現明顯的鎘損傷癥狀[14]。在含鎘日糧中添加200 mg·kg-1MHZn時，肝鎘含量顯著降低，并有效緩解了肝病理學損傷。同時，含鎘日糧組仔豬腎鎘含量顯著增加，并導致部分腎小管上皮細胞變性、脫落，核固縮，淋巴細胞增生。而MHZn可有效緩解腎小管上皮細胞的變性和損傷，減少淋巴細胞的增生，表明MHZn可通過減少腎的鎘蓄積，進而減少腎的鎘損傷。因此MHZn能夠緩解肝腎的鎘損傷。

鎘作為二價金屬離子，與其他二價微量元素，如鋅、銅、鐵、鈣等的物理、化學性質相似，因此鎘可與微量元素競爭二價金屬離子轉運載體，例如二價金屬轉運蛋白1(DMT1)、膜鐵轉運蛋白(FPN1，鐵和鎘共用的轉運載體)和ZRT/IRT樣蛋白1(ZIP8)等[28]。由于鎘與部分轉運載體的親和力高于其它微量元素與轉運載體的親和力，會導致鎘被大量吸收，機體出現部分微量元素缺乏的情況[29]。本研究發現，含鎘日糧在引起臟器鎘蓄積的同時，還導致了腎中銅、鋅，肝中錳等二價金屬離子的升高，這可能與鎘對二價金屬離子轉運載體的調控以及機體的代償機制有關。另一方面，含鎘日糧降低了肝、腎中鐵的含量，表明鎘的競爭導致機體對鐵的吸收受到抑制。當含鎘日糧中添加MHZn(HMHZn組)時，仔豬肝、腎中的鎘蓄積顯著減少(P<0.05)，表明MHZn抑制了機體對鎘的吸收與蓄積，有助于減少鎘對機體的損傷。同時，由于鎘、鋅與其他微量元素的競爭關系[30]，鎘和MHZn的使用影響了其他微量元素的吸收和利用，那么同時添加多種氨基酸螯合微量元素是否更有助于減少鎘毒性、維持機體微量元素水平還有待進一步研究。

含鎘日糧降低了血漿白蛋白(ALB)和總蛋白(TP)的含量，而血漿ALB和TP的降低，與肝、腎功能異常和消化道疾病密切相關[31]，表明鎘影響了機體肝、腎和消化道的功能。在含鎘日糧中添加MHZn時，鎘對ALB和TP的影響有所緩解。二胺氧化酶(DAO)是存在于哺乳動物黏膜或絨毛上層細胞胞漿中一種活性較高的細胞內酶，其活性和黏膜細胞內的核酸和蛋白質合成密切相關。腸黏膜和外周血中DAO活性的高低可有效反映腸上皮細胞的完整性和成熟程度[32]。腸黏膜細胞受損時，DAO酶活升高。本研究發現，含鎘日糧導致仔豬DAO酶活升高，表明腸黏膜存在一定的損傷，而HMHZn組的DAO酶活顯著低于Cd組(P<0.05)，進一步表明MHZn有助于減少鎘對腸黏膜的損傷。

4 結 論

本研究結果表明，日糧添加100和200 mg·kg-1的 MHZn可有效減少含鎘飼料對仔豬的影響，提高仔豬的生長性能，減少肝、腎中的鎘蓄積及鎘的致毒性，顯著降低鎘對小腸絨毛的損傷。

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