馬立克病病毒miR-M4-5p宿主靶基因cDNA文庫的構建及鑒定

薛正飛，滕 蔓，李會珍，馬圣明,3，宋利娜，張 雅，羅 俊,3，張改平*

(1. 河南農業大學，生命科學學院，鄭州 450002； 2. 河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3. 河南科技大學，動物科技學院，動物疫病與公共安全重點實驗室，洛陽 471003)

馬立克病(Marek’s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染雞引起的一種腫瘤性免疫抑制性傳染病[1]。MDV屬于皰疹病毒科,α-皰疹病毒亞科,馬立克病毒屬。依據生物學特性的不同,MDV可分為血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(HVT)三種血清型[2],而在最新的病毒分類中又被重新命名為禽皰疹病毒2型(GaHV2)、禽皰疹病毒3型(GaHV3)和火雞皰疹病毒Ⅰ型(MeHV1)[3]。其中,僅MDV-1具有致病性和致瘤性。目前,雖然可以用疫苗較好地預防MD腫瘤發生,但由于疫苗免疫壓力及病毒自身進化等原因,MDV流行毒株的毒力正不斷增強[4]。MDV感染雞群后不僅導致宿主免疫抑制,而且可快速誘發腫瘤及大批雞死亡,因此MDV感染被認為是研究皰疹病毒致病和致腫瘤的理想模型[5]。

microRNA(miRNA)是一類長度為21～25 nt的非編碼小分子RNA,它們在細胞的發育與分化、細胞凋亡、腫瘤發生等許多生物學過程中調控蛋白編碼基因的轉錄后表達水平[6-7]。 MDV-1共編碼26個成熟體miRNA,其中miR-M4-5p與宿主miR-155具有相同的種子序列,是miR-155的同源物[8]。由于miR-155參與調控許多腫瘤的形成過程,被認為是致癌基因[9-13],miR-M4-5p可能也發揮著類似的重要作用。最近的研究表明miR-M4-5p在MDV致瘤性方面直接發揮著重要作用。敲除miR-M4-5p的MDV致病和致瘤能力顯著減弱[14]，但具體的作用機制仍然不是十分清楚。此前通過生物信息學軟件預測和試驗驗證,我們已證實LTBP1是miR-M4-5p一個重要的宿主靶基因[15]。由于生物信息學方法預測miRNA的靶基因存在候選分子眾多、篩選及鑒定工作量大等缺點,本研究采用hybrid-PCR的策略構建miR-M4-5p的宿主候選靶基因cDNA文庫[16],通過雙熒光素酶報告試驗(dual fluorescence reporter assays, DLRA)分析miR-M4-5p與候選靶基因的相互作用,為進一步揭示miR-M4-5p的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞

HEK 293T細胞由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室保存；雞胚成纖維細胞(chick embryo fibroblast,CEF)分離自7～8日齡SPF雞胚。

1.2 主要試劑、載體

TRIzol Reagent，購自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase、PremixTaqTM、DNA限制性內切酶XhoⅠ、NotⅠ、PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser、DNA Ligation kit和pMD19-T(simple)vector,均購自寶生物工程(大連)有限公司；DLRA系統,購自Promega公司；Annealing Buffer for Oligos(5×),購自碧云天生物科技公司；psiCHECK-2和pcDNA6.2-miR-neg載體,由中山大學徐輝博士饋贈；pcDNA6.2-miR-M4-5p、pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p質粒和菌種[15],由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室構建并保存。

1.3 引物合成

本研究使用的DNA引物均使用Premier Primer 5.0軟件設計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名稱、序列等相關背景信息見表1。

表1 用于擴增或合成候選靶基因3′-UTR的引物

Table 1 Primers used for amplifying the wild type or mutated 3′-UTRs of putative mRNA targets

編號No.引物名稱Primername序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴增長度/bpAmplicon1CSNK2A2-3'-UTR-FCSNK2A2-3'-UTR-RCTCGAGATTCACAGTTGCCTCCTGCGGCCGCGAATATGGAATGTAAACAGAT1992PDK3-3'-UTR-FPDK3-3'-UTR-RCTCGAGGGCTTCTGACAGTGGGAGCGGCCGCAAAACATCAAGTAATCTC1993PRICKLE1-3'-UTR-FPRICKLE1-3'-UTR-RCTCGAGTCCCTGAATTTGAAGAAGCGGCCGCGACCCATAAATAACACT2424SEPT2-3'-UTR-FSEPT2-3'-UTR-RCTCGAGAAGTGAGACCACCATTCGCGGCCGCAAGCTCTGCAAATTCAA1755PPFIBP1-3'-UTR-FPPFIBP1-3'-UTR-RCTCGAGTTCTACTCCAAACACCCTGGCGGCCGCTTACGTTGCCCTCTTCA1966COLA-3'-UTR-FCOLA-3'-UTR-RCTCGAGACCCAACTTGCTTTCATGCGGCCGCTTACAGAGCAGCCATCC2057WWTR1-3'-UTR-FWWTR1-3'-UTR-RCTCGAGTGTCCTCAGGCTTCGTTGCGGCCGCCTGGTACTGGCAGATGG2428BCAT1-3'-UTR-FBCAT1-3'-UTR-RCTCGAGTACTGGATAAACTAAAGGAAGCGGCCGCTTGATGAGGAAAACTGC2049MMP2-3'-UTR-FMMP2-3'-UTR-RCTCGAGTTTGCTTCCTGCACTTTGCGGCCGCTGAGAAACATTCCATCA22010RCN1-3'-UTR-FRCN1-3'-UTR-RCTCGAGATCTGTTCTGAATGCTAAAGGCGGCCGCCTACAGGGAGAGCATAAACC22511ANTXR1-3'-UTR-FANTXR1-3'-UTR-RCTCGAGGAATGGGATTTGGTGAGGCGGCCGCGCTTCAGATTTATGGGTT18112PELI2-3'-UTR-FPELI2-3'-UTR-RCTCGAGGTCCCTTCTGCTTCCATGCGGCCGCCTTCCACGGGTACAACA24413TECPR1-3'-UTR-FTECPR1-3'-UTR-RCTCGAGGACTGAGGGTGCTGTAGGCGGCCGCGATTTTATTTGGATGAGC16214VAPB-3'-UTR-FVAPB-3'-UTR-RCTCGAGGCAAGATTCTTCTGCCTCCGCGGCCGCCATCAAACAGGATTGGTCTT18115CIRBP-3'-UTR-FCIRBP-3'-UTR-RCTCGAGATGGACACTGGGCTTGGGCGGCCGCCGTTGGCTTTCCTGCTC21216RFXAP-3'-UTR-FRFXAP-3'-UTR-RCTCGAGTGGTGGAGGTGCTTGCTGCGGCCGCCACAAAACAATTCTTGGTCC22717TBC1D9B-3'-UTR-FTBC1D9B-3'-UTR-RCTCGAGGTGCTGAAGGCAAGGAGGCGGCCGCTACAGGGCAGAGGAGGC18718NT5C3A-3'-UTR-FNT5C3A-3'-UTR-RCTCGAGGAATAAGCCGCGTGCATGGGGCGGCCGCAAGAAAAATATGTATGAAAA18919ITGB5-3'-UTR-FITGB5-3'-UTR-RCTCGAGAGTTGTGCTCGTGGATTGCGGCCGCAACTCTTGTATCCTAATTTC24120CARHSP1-3'-UTR-FCARHSP1-3'-UTR-RCTCGAGGCTGTCTGCGTGGGTCAGCGGCCGCGCATCTGGATTGCCTTT18521GMPS-3'-UTR-FGMPS-3'-UTR-RCTCGAGGCTACATCCCACCTGACGCGGCCGCTTAACAACCGGAACACG190

(轉下頁 Carried forward)

1.4 候選靶基因文庫的構建

按照TRIzol RNA提取試劑盒說明書,提取CEF細胞的總RNA。用NanoDrop-2000全波長紫外分光光度計(Invitrogen公司)測定RNA濃度和純度。按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒說明書，將提取的RNA樣品進行反轉錄合成cDNA，然后進行套式PCR反應。PCR反應中miR-M4-5p的種子序列特異性上游錨定引物序列為5′-GRRGGGTTCCGRTRCRGCRTTR-3′(由于miRNA在結合靶基因時,允許G:U配對，所以在設計合成特異性錨定引物時，將與U對應的堿基用R代替，表示A或G堿基)。取全部PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳分析3′ RACE PCR產物，用膠回收試劑盒回收介于150～1 000 bp的全部PCR產物,連接到pMD19-T載體并轉化JM109感受態細胞鋪板培養,挑選單克隆菌落擴大培養,用miR-M4-5p種子序列特異性錨定引物和inner引物(TaKaRa)進行菌液PCR鑒定,將陽性克隆菌的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。分析測序結果,通過BLAST進行序列相似性比對分析,確定候選靶基因的名稱和基因全序列。

1.5 雙熒光素酶報告載體的構建

以CEF基因組cDNA為模板,優先擴增miRNA結合靶點在3′-UTR區域內的29個候選靶基因片段。PCR反應體系包括:ExTaq10 μL,候選靶基因3′-UTR上下游引物(表1,#1～29)各1 μL (10 μmol·L-1),CEF cDNA 1 μL(100 ng·μL-1)和ddH2O 7 μL。PCR程序:95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物經膠回收后,連接pMD19-T載體,轉化JM109感受態細胞挑單菌落PCR鑒定陽性后送測序,將目的片段從測序正確的T載體上切割下來并回收,與同樣酶切處理的psiCHECK-2回收載體產物4 ℃過夜連接,然后轉化JM109感受態細胞,涂氨芐抗性平板培養過夜,挑單菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將合成的3′-UTR突變寡核苷酸(表1,#30～36)分別用ddH2O溶解至終濃度為50 μmol·μL-1,進行退火反應。反應體系包括: 無核酸酶水40 μL,寡核苷酸退火緩沖液(5×) 20 μL,正、反寡核苷酸鏈各20 μL (50 μmol·L-1)。反應程序: 95 ℃變性2 min,然后每90 s下降1 ℃直至25 ℃。同上所述,構建雙熒光報告載體。

1.6 雙熒光素酶報告試驗

psiCHECK2-3′-UTR和pcDNA6.2-miR-M4-5p質粒各取300 ng,均勻混于12.5 μL無血清培養基中,按照48孔細胞板每孔1 μg Lipofectamine 2000和12.5 μL質粒的比例均勻混合,按Lipofectamine 2000說明書,將孵育后的Lipofectamine 2000和混合質粒(25 μL·孔-1)共轉染匯合度為80%～90%的HEK 293T細胞。以pcDNA6.2-miR-neg為陰性對照,每組均設3個重復,在37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養。

轉染36 h后,將HEK 293T細胞培養基棄去,用PBS洗2次,然后用DLRA系統進行報告基因檢測。首先用20 μL ddH2O稀釋細胞裂解液裂解細胞,室溫孵育15 min。然后將細胞裂解液轉移至96孔白底透明酶標板中,每孔加入100 μL LAR II,輕柔混合均勻后用Ω酶標儀(OMG Labtech)測定螢火蟲熒光素酶數值。最后向每孔加入100 μL Stop and Glo Reagent,輕柔混合均勻后,同上測定海腎熒光素酶數值。最后統計分析海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性比值。

2 結 果

2.1 miR-M4-5p宿主候選靶基因cDNA文庫的構建

將hybrid-PCR產物電泳分析后割膠回收(圖1),連接pMD19-T載體,轉化E.coliJM109后鋪板培養,挑取600個單菌落接菌活化后進行菌液PCR鑒定,共有580個菌落可以擴增出目的條帶(圖2),將這580個樣品送樣測序,共獲得403個有效的基因序列。BLAST分析獲得88個單一基因序列(表2)。其中,結合位點在3′-UTR的基因有63個,結合位點在CDS的基因有20個,結合位點在5′-UTR的基因有5個。結合位點在3′-UTR的63個基因中有29個基因的結合位點與miR-M4-5p的種子區完全互補(包括G:U)。我們優先選擇這29個基因進行下一步的DLRA試驗分析。

M. DNA marker圖1 Hybrid-PCR特異性引物示意圖(A)和hybrid-PCR產物電泳分析(B)Fig.1 Schematic of miR-M4-5p hybrid primer (A) and agarose gel electrophoresis of PCR products (B)

M. DNA相對分子質量標準; 1～12. 菌液克隆號M. DNA marker; 1-12. Clone number of bacterial fluid圖2 Hybrid-PCR產物的部分菌液PCR產物電泳分析Fig.2 Identification of part hybrid-PCR products by agarose gel electrophoresis

表2 miR-M4-5p靶標文庫候選基因列表

Table 2 Putative target mRNAs of miR-M4-5p

編號No.基因Gene結合位置Bindingsite編號No.基因Gene結合位置Bindingsite編號No.基因Gene結合位置Bindingsite1CSNK2A23'-UTR31RAC13'-UTR61PPM1E3'-UTR2PDK33'-UTR32RBM243'-UTR62PCYT1A3'-UTR3PRICKLE13'-UTR33FKBP73'-UTR63SLC12A43'-UTR4SEPT23'-UTR34MARCKS3'-UTR64RPL27CDS5PPFIBP13'-UTR35NDFIP13'-UTR65RPL12CDS6COLA3'-UTR36ST53'-UTR66CCT2CDS7WWTR13'-UTR37PARD3B3'-UTR67ALAS1CDS8BCAT13'-UTR38RPL173'-UTR68USP14CDS9MMP23'-UTR39SEC16A3'-UTR69ALDH7A1CDS10RCN13'-UTR40CDC423'-UTR70MAP1BCDS11ANTXR13'-UTR41ATP6AP23'-UTR71PSPHCDS12PELI23'-UTR42P4HA13'-UTR72SSBP1CDS13TECPR13'-UTR43TTC193'-UTR73RPS12CDS14VAPB3'-UTR44EPB41L33'-UTR74EXOC3CDS15CIRBP3'-UTR45CCT33'-UTR75COX6CCDS16RFXAP3'-UTR46USPL13'-UTR76RFTN2CDS17TBC1D9B3'-UTR47SSBP23'-UTR77KIAA0947CDS18NT5C3A3'-UTR48MMP163'-UTR78KPNB1CDS19ITGB53'-UTR49APOA13'-UTR79DHX36CDS20CARHSP13'-UTR50DYNC1H13'-UTR80RBBP6CDS21GMPS3'-UTR51LOC4288243'-UTR81TOR1AIP1CDS22BTAF13'-UTR52ANKRD13'-UTR82DNAJA4CDS23AMOTL13'-UTR53TMEM113'-UTR83SEC23BCDS24DAZAP13'UTR54EMG13'-UTR84EBF35'-UTR25NOL83'-UTR55SUMO33'-UTR85CCDC805'-UTR26LOC7768163'-UTR56COCH3'-UTR86CPEB45'-UTR27IGF2R3'-UTR57PSMG43'-UTR87DEDD5'-UTR28RAB3GAP13'-UTR58TAF1D3'-UTR88EIF4A25'-UTR29DDX3X3'-UTR59NRAS3'-UTR30PTGES33'-UTR60FXYD63’-UTR

UTR.非編碼區；CDS.編碼區

UTR. Untranslated regions; CDS. Coding sequence

2.2 雙熒光素酶報告載體的構建及鑒定

利用表1所示的引物對#1-29,通過PCR從CEF基因組cDNA中擴增29個候選靶基因的部分3′-UTR片段(圖3A),經測序分析確定目的序列與預測完全相符,分別提質粒進行雙酶切后電泳割膠回收上述PCR產物,將純化的3′-UTR PCR產物分別連接到psiCHECK2載體上,通過雙酶切驗證和測序鑒定,成功構建了29個psiCHECK2-3′-UTR報告載體(圖3B)。

M. DNA marker 圖3 候選靶基因3′-UTR的PCR擴增(A)和psiCHECK2-3′-UTR重組質粒酶切鑒定(B)Fig.3 The PCR amplification of 3′-UTRs of target genes (A) and identification of the recombinant psiCHECK2-3′-UTR plasmid by double enzyme digestion (B)

2.3 雙熒光素酶報告試驗

第一輪DLRA篩選,將psiCHECK2-3′-UTR質粒分別和pcDNA6.2-miR-M4-5p質粒或陰性對照質粒pcDNA6.2-miR-neg共轉染HEK 293T細胞,36 h后用DLRA系統檢測熒光值并計算相對熒光素酶活性(即海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值)。結果顯示,在29個候選靶基因中,有19個基因的psiCHECK2-3′-UTR質粒與pcDNA6.2-miR-M4-5p質粒共轉染HEK 293T細胞的海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值顯著低于陰性對照組的比值(圖4)。

第二輪DLRA篩選,將第一輪篩選到的19個候選基因再次重復試驗,但同時加上psiCHECK2-3′-UTR質粒和pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p質粒共轉染組,DLRA結果顯示有7個候選基因的psiCHECK2-3′-UTR質粒和pcDNA6.2-miR-M4-5p質粒共轉染組的熒光比值與pcDNA6.2-miR-neg質粒或pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p質粒對照組差異均顯著(圖5)。

第三輪DLRA篩選,首先構建第二輪中篩選獲得的7個候選基因的3′-UTR突變體psiCKECK2重組質粒,然后同時用這些psiCHECK2-3′-UTR突變體質粒代替psiCHECK2-3′-UTR質粒進行DLRA試驗。結果發現PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1的3′-UTR突變后失去抑制效果,而TBC1D9B的3′-UTR突變后仍有抑制效果,NT5C3A的psiCHECK2-3′-UTR質粒和pcDNA6.2-miR-M4-5p質粒共轉染組的熒光比值與陰性對照組差異不顯著(圖6)。三輪DLRA結果表明,PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1可以確定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

誤差線表示三次獨立重復試驗的標準差。*.差異顯著(P<0.05)Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖4 DLRA分析miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR的體外相互作用Fig.4 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p and the 3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

誤差線表示三次獨立重復試驗的標準差。*.差異顯著(P<0.05)Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖5 DLRA分析miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR突變體的體外相互作用Fig.5 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p and the mut-3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

3 討 論

miRNA通過與不同靶基因相互作用,可以調控多種生物學過程。近年來,發現MDV編碼的病毒miRNA在MD腫瘤的發生發展過程中可能發揮重要作用。之前的動物攻毒試驗數據也顯示,缺失miR-M4前體基因的MDV突變毒株與其親本毒株相比致瘤率顯著下降[14]。通過生物信息學軟件預測和試驗驗證,已經證實了miR-M4-5p可在感染宿主體內靶向調控宿主基因LTBP1的表達,影響TGF-β的成熟及向胞外分泌的過程,進而抑制TGF-β信號通路來激活原癌蛋白c-MYC的過表達,最終可能促進誘導MD腫瘤的發生[15]。目前有多種軟件可用于miRNA的靶基因預測與分析,但在具體分析時主要遵循以下幾個原則,如miRNA與靶基因的互補性、靶基因在不同物種間的保守性、miRNA-mRNA之間形成雙鏈的穩定性等。除了生物信息學方法之外,也開發出了很多其他有效的研究策略和方法[17]。用hybrid-PCR通過錨定引物尋找特定miRNA的候選靶基因的方法最早是在2011年提出來的[16],通過模擬miRNA在體內與mRNA的靶向結合調控過程,利用PCR擴增出特定的基因片段,結合生物信息學分析初步鑒定這些錨定擴增出來的候選基因,從而構建一個相對軟件預測來說更為可信的候選靶標文庫,大大降低了后期試驗驗證的工作量。如果再綜合生物學軟件預測結果可以更好地優化miRNA靶基因篩選與鑒定的實驗流程,極大地提高研究效率。

針對MDV-1編碼的miR-M4-5p，我們之前通過軟件預測并參考相關文獻已經找到了一個重要的靶基因LTBP1。本研究中我們又采用hybrid-PCR構建候選靶標cDNA文庫,初步篩選鑒定的克隆中有63個候選靶基因的預測結合位點位于3′-UTR,其中只有25個候選靶基因的預測結合位點在CDS或5′-UTR。在這些候選靶基因中，尚未發現此前已報道鑒定的miR-M4-5p宿主靶基因，這可能與目前篩選鑒定的克隆數量有關，也可能與候選靶基因的表達豐度有關，因為hybrid-PCR過程可能會導致高豐度表達的基因掩蓋低豐度基因。多數情況下,miRNA結合到靶基因mRNA的3′-UTR區域以發揮調控作用,因此我們首先關注靶標文庫中結合位點在3′-UTR的63個候選靶基因。進一步分

下劃線序列為突變的種子序列或靶點序列;誤差線表示三次獨立重復試驗的標準差。*.差異顯著(P<0.05)The underlined nucleotide sequences indicate the mutated seed sequences or binding sites; Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖6 DLRA分析miR-M4-5p、mut-miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR及mut-3′-UTR的體外相互作用Fig.6 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p or mut-miR-M4-5p and the 3′-UTR or mut-3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

析這63個候選靶基因的結合位點,發現有29個候選靶基因的預測靶點序列與miR-M4-5p種子區完全互補匹配,其他則不完全匹配。miRNA的種子區對其調節功能影響很大,即使一對堿基不互補都可能會顯著影響其調節功能,所以我們優先針對與miR-M4-5p種子區完全互補的29候選靶基因進行下一步的DLRA鑒定工作。經過3輪篩選,逐步縮小篩選范圍。第一輪篩選初步驗證了19個候選靶基因可以與miR-M4-5p相互作用；第二輪篩選進一步驗證了7個候選靶基因與miR-M4-5p的相互作用具有種子序列依賴性；而第三輪篩選通過種子序列及靶點雙突變驗證分析,最終將PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1這5個基因鑒定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

在這5種初步鑒定的宿主靶基因中,COLA編碼的蛋白質目前尚無相關功能報道。ANTXR1是跨膜蛋白,其生理狀態下的功能尚不十分清楚,可能參與細胞外基質穩態的維持[18-19]。PRICKLE1編碼一種核受體,位于細胞膜表面,其對Wnt/β-catenin信號通路存在負調節作用[20]。miR-M4-5p對PRICKLE1的調控,可能進一步影響Wnt/β-catenin,從而改變多種基因表達,影響細胞的增殖和死亡。BCAT1編碼支鏈氨基酸轉移酶1,為支鏈氨基酸分解代謝過程中的關鍵酶,參與支鏈氨基酸的代謝過程,為組織細胞的生長代謝提供能量[21],miR-M4-5p對BCAT1的負向調控可能削弱宿主的體質和免疫能力,從而有利于MDV對宿主的感染。TECPR1編碼的蛋白是一種有關選擇性自噬的膜融合相關蛋白,在自噬小體的成熟及促進自噬小體與溶酶體融合方面起著重要的作用[22]。其可能參與MDV感染中對宿主的免疫抑制作用,從而有助于MDV在宿主體內的感染和增殖，逃避宿主的免疫保護。DLRA試驗只是在體外驗證了miR-M4-5p與宿主候選靶基因的相互作用,接下來仍需要利用實時熒光定量PCR、蛋白質印記等實驗方法檢測miR-M4-5p在體內是否對上述候選靶基因具有靶向調節作用,為進一步深入研究miR-M4-5p介導MDV感染及致瘤的分子機制奠定重要的基礎。

4 結 論

通過hybrid-PCR建庫及序列相似性比對分析,構建了miR-M4-5p的宿主候選靶基因cDNA文庫；成功構建了29個候選靶基因的3′-UTR熒光素酶驗證載體和突變載體；經過3輪DLRA分析表明PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1可與miR-M4-5p在體外相互作用，初步鑒定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

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