豬鏈球菌通用型和2型雙重熒光定量PCR快速檢測技術的建立和應用

吳靜波，南文金，黃健強，胡鴻惠，彭國良，彭 凌，董小英

(韶關學院粵北生豬生產及疫病防控協同創新發展中心，韶關 512005)

豬鏈球菌是造成生豬養殖業重大經濟損失的主要病原之一，全球幾乎100%規模化豬場均有豬鏈球菌存在[1]。該菌可通過呼吸道相互傳播，主要引起敗血癥、腦膜炎、關節炎、肺炎、心內膜炎等。同時豬鏈球菌也是一種人獸共患病病原，可通過接觸帶菌豬或豬肉產品感染人，引起敗血癥、腦膜炎，甚至休克樣綜合征，導致死亡[1]。盡管50年來人感染豬鏈球菌大多為職業接觸性的散發病例，比如養殖戶、獸醫、屠夫、食品加工者等職業人群[2]；但最近幾年人感染豬鏈球菌病例的數量不斷增加，并趨向于常規人群。在中國有過兩次豬鏈球菌2型的區域大流行，分別為1998年江蘇25人感染14人死亡和2005年四川215人感染38人死亡，嚴重威脅公共衛生安全[2-4]。

豬鏈球菌為革蘭陽性球菌，是豬的正常寄生菌，主要定植在豬的上呼吸道中，尤其是在扁桃體和鼻腔，也可定植于生殖器和消化道內[5-6]。根據莢膜多糖的抗原性，將豬鏈球菌分為35個血清型(1～34型及1/2型)，在所有血清型中1、2、1/2、7、9、14型為豬群中的主要致病血清型[7]，2、14型為人群中的主要致病血清型[1]。調查顯示不管是在人群還是豬群中，2型都是最為主要的致病菌，致病力和流行率都是最高的，占全球病例數的74.7%和27.9%，是疫情監控和病原鑒定的首要檢測對象[1,3,8]。

目前細菌分離培養與血清學分型結合仍然是診斷豬鏈球菌的金標準[1,9]，但此方法耗時，靈敏度低，操作要求高，不利于推廣和疫情監測[10-11]，另外血清學方法也無法檢測出無莢膜菌株和自凝菌株[12-15]。對此研究者建立了單個或多重PCR、MLST、熒光PCR等方法對豬鏈球菌保守基因或不同血清型特異的莢膜多糖基因進行擴增與測序[10,13,16-24]，在基因水平上實現對豬鏈球菌的鑒定與分型，彌補了血清學分型的不足，提高了檢測的準確性和靈敏度。其中就包括多個豬鏈球菌通用型或2型的TaqMan熒光PCR方法，但這些方法都為單熒光PCR，無法實現單管內同時檢測豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，增加了疫情監測的工作量和成本。本研究采用TaqMan多重熒光PCR技術，以豬鏈球菌的保守基因gdh和2型特異性基因cps2J為靶基因設計兩個不同熒光基團標記的探針，建立了SS通用型和2型特異性的雙重熒光定量PCR檢測方法，并對該方法的靈敏度、特異性、重復性進行檢測；同時與常規PCR對比，檢驗其實際應用價值，力求建立一個快速、穩定、準確的雙重檢測方法。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株

所使用菌株均為本實驗室保存，包括9株經標準血清和血清型特異性PCR確定的豬鏈球菌1、1/2、2、3、4、7、9、14、16型；11株陰性對照菌，分別為大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎鏈球菌(ATCC 49619)、化膿性鏈球菌(ATCC 19615)、糞腸球菌(ATCC 29212)、乙型溶血性鏈球菌(ATCC 21059)、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、敗血波氏桿菌、豬鼻支原體(CVCC 361)、馬鏈球菌獸疫亞種(CVCC 573)。

1.2 引物探針設計

gdh基因是豬鏈球菌的保守基因[25-26]，在不同血清型中的一致性達到96%；cps2J是豬鏈球菌2型的型特異性基因[27]，在血清型內較為保守，一致性達到99%。我們以豬鏈球菌2型參考株P1/2的基因組為參考序列(GenBank登錄號:AM946016)，根據gdh和cps2J基因的保守區域分別設計引物和探針，要求兩靶基因的引物及探針之間無非特異性反應，序列如表1所示。使用FAM熒光素標記gdh檢測探針，用于豬鏈球菌通用型的檢測；使用HEX熒光素標記cps2J探針，用于豬鏈球菌2型的檢測。使用MAGA 5.1和Oligo 7進行多重比對和引物探針設計，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 優化雙重熒光定量PCR反應條件

試驗使用ABI 7500熒光定量PCR系統(ABI公司，美國)進行擴增和分析，以Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(RR390，TaKaRa,中國)作為反應緩沖液。首先在緩沖液推薦的反應體系下進行退火溫度的優化，設置6個退火溫度，分別為50、52、54、56、58、60 ℃，反應條件為95 ℃ 5 min進行預變性及啟動Taq酶，然后95 ℃ 15 s變性，50～60 ℃退火延伸30 s并收集熒光，共40個循環。在確定退火溫度后則對引物和探針反應濃度進行優化，設計3×3矩陣表(如表2)分9個組，包括3個引物濃度(200、300、400 nmol·L-1)和3個探針濃度(100、150、200 nmol·L-1)。反應使用25 μL反應體系，包括12.5 μL Premix ExTaqbuffer(2×)，0.5 μL的引物(10 μmol·L-1)和探針(5 μmol·L-1)，1 μL的豬鏈球菌2型基因組DNA樣品，0.25 μL ROX Reference Dye(50×)，無RNA酶水補至25 μL。

表1 引物和探針序列

Table 1 Sequences of primes and probes

名稱Name序列(5'-3')aSequence(5'-3')a基因組中位置bGenomepositionb產物大小/bpAmpliconsizeGDH-FGAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC240807—240829114GDH-R/SRcCCATGGAACACGGAAGCTG240716—240734GDH-PFAM-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-TAMRA240773—240801214GDH-SFcGGAATTCCATATGTCAAATGCC240908—240919CPS2J-FGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT563492—56351793CPS2J-RCCATTTGGTAACCGGAAAAGTT563563—563584CPS2J-PdHEX-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-TAMRA563533—563558CPS2J-SFcAGGAATTCCATATGGAAAAAGTCAGCATTATTG563385—5634061019CPS2J-SRcCCGCTCGAGTTAATCATTATTTTTTTCTTCCC564361—564383SS2-FeGATTTGTCGGGAGGGTTACTTG450SS2-ReTAAATAATATGCCACTGTAGCGTCTCSSall-FeTTCTGCAGCGTATTCTGTCAAACG695SSall-ReTGTTCCATGGACAGATAAAGATGG

a. 下劃線標記的為限制性酶切位點；b. 引物探針所在的基因組位置是參照豬鏈球菌2型P1/7株的序列，其中gdh的引物探針序列為基因組的反向序列；c. SF和SR為質粒標準品的普通PCR引物，其中GDH-R/SR同時應用于雙重熒光定量PCR和普通PCR中；d. CPS2J-P為下游探針；e. 引物序列參考文獻[17]

a. The underscores is the restriction site;b. Genome positions were numbered according to reference sequence AM946016.1 (Serotype 2),gdhsequence is a reverse sequence;c. SF and SR were primers of conventional PCR for standard DNA, GDH-R/SR was used to duplex Real-Time PCR and conventional PCR;d. CPS2J-P is a reverse probe;e. Reference from relative reference[17]

表2 引物及探針濃度的矩陣分組情況

Table 2 The groups of difference concentration of primer and probe

探針濃度/(nmol·L-1)Probeconcentration引物濃度/(nmol·L-1)Primerconcentration200300400100A1A2A3150B1B2B3200C1C2C3

1.4 質粒標準品制備

為繪制雙重熒光定量PCR的標準曲線，我們在熒光定量PCR引物兩側又設計了一對引物用于構建標準品DNA，序列為表1所示的GDH-SF、GDH-SR(與熒光定量PCR引物相同)、CPS2J-SF、CPS2J-SR，擴增產物長度分別為214和1 019 bp。產物經1%瓊脂糖電泳分離后用凝膠回收試劑盒(cat#9762，TaKaRa，中國)回收，與pMD-18T(TaKaRa，中國)載體連接后轉入DH5α感受態(TaKaRa，中國)培養過夜，使用質粒提取試劑盒純化pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J質粒，經NanoDrop ND-2000C(Thermo，美國)測得濃度后計算質粒原始拷貝數，然后用標準品稀釋液(TaKaRa，中國)將兩質粒標準品連續10倍稀釋為4×108～4×101copies·μL-18個梯度，每個梯度3個復孔進行擴增，繪制標準曲線，計算相關系數和擴增效率。

1.5 特異性、靈敏度、重復性

用我們建立的方法對“1.1”所述的9株豬鏈球菌和11株陰性菌株的基因組DNA進行檢測，驗證方法能否在準確鑒定出豬鏈球菌的同時不對陰性對照菌產生非特異性反應；并驗證豬鏈球菌2型的特異性引物和探針是否對其他血清型的豬鏈球菌不產生非特異反應。

對兩個質粒標準品分別稀釋至40、20、10、5、2.5 copies·μL-15個梯度，每個梯度3個復孔，然后用我們最優擴增體系和條件進行檢測，測定最低檢出極限。

使用“1.4”稀釋的質粒標準品4×107～4×103copies·μL-15個梯度進行重復檢測，每個梯度3個復孔，在不同時間點進行3次檢測；計算檢測結果的批內和批間的變異系數，以測定雙重熒光定量PCR的重復性。

1.6 臨床樣品檢測

用基因組DNA提取試劑盒(cat#9765，TaKaRa，中國)對實驗室收集的67份呼吸道疾病和關節炎的臨床病料(包括鼻拭子、關節液、扁桃體、肺等)進行細菌基因組DNA提取；用我們建立的雙重熒光定量PCR和已公布的常規PCR方法[17]平行檢測獲得的DNA模板。兩方法結果判定標準如下：熒光定量PCR以出現典型擴增曲線為陽性，并根據Ct值和標準曲線計算樣品模板拷貝數；普通PCR以電泳檢測時出現目的片段為陽性。根據試驗結果，使用SPSS軟件分析兩種PCR方法的符合率和一致性(kappa系數)；以普通PCR結果為參照，繪

制ROC曲線，計算雙重熒光定量PCR檢測的最佳陽性閾值。

2 結 果

2.1 雙重熒光定量PCR最優反應條件

在對同一個樣品的重復檢測中，6個退火溫度的Ct值、擴增曲線斜率和線型均沒有明顯的差異，但56 ℃下的結果稍好于其他退火溫度(數據未顯示)；9個引物和探針濃度組合的雙重熒光定量PCR擴增結果如圖1示，結合兩個靶基因的擴增曲線，可以看出C組的擴增曲線比其他兩組具有更大的斜率和更小的Ct值，而C1又稍優于C2和C3組。所以雙重熒光定量PCR的最優退火溫度為56 ℃，最優引物和探針濃度為200 nmol·L-1。

字母A、B、C表示探針濃度100、150、200 nmol·L-1，數字1、2、3表示引物濃度200、300、400 nmol·L-1，NC為陰性對照In the group name, A, B, C represent 100, 150, 200 nmol·L-1 probe concentration, respectively; and number 1, 2, 3 represent 200, 300, 400 nmol·L-1 primers concentration, respectively. NC represent negative control圖1 9個引物和探針濃度優化組合的擴增曲線圖Fig.1 Amplification curves of duplex real-time PCR for S. suis and S. suis 2 at 9 concentration groups of primer and probe

2.2 標準曲線繪制

在最優雙重熒光定量PCR條件下分別對質粒標準品pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J的檢測，均只單獨出現FAM和HEX熒光曲線，即相互之間不存在非特異擴增。PCR的擴增結果如圖2所示。8個濃度梯度的Ct值與對應的拷貝數的lg值呈現線性關系，且線性范圍極寬；豬鏈球菌和豬鏈球菌2型的線性公式分別為y=-3.291 1x+41.154和y=-3.342 4x+41.562(y為Ct值，x為lg原始拷貝數)，相關系數(R2)分別為0.999 4和0.999 3，擴增效率分別為101.303%和99.157%。

2.3 特異性、靈敏度、重復性

雙重熒光定量PCR方法在檢測9株豬鏈球菌(1、2、1/2、3、4、7、9、14、16型)基因組DNA時FAM熒光(gdh基因)均為陽性，但只有檢測2和1/2型時HEX熒光(cps2J基因)才為陽性，而在對11株陰性對照菌的檢測中雙熒光都為陰性(結果未顯示)；表明這個方法可特異性鑒別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型。

測定雙重熒光定量PCR方法檢測極限的結果如圖3所示，在最優反應條件下對5 copies·μL-1以上模板量的擴增均能出現典型的擴增曲線，即檢測極限值為5拷貝數。但是在低于10 copies·μL-1時試驗的穩定性會下降(結果未顯示)。

圖2 質粒標準品DNA的擴增曲線圖和標準曲線圖Fig.2 Duplex RT-PCR amplification plots and standard curves of single plasmid standard DNA for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

40、20、10、5、2.5表示質粒標準品的拷貝數(copies·μL-1)40, 20, 10, 5, 2.5 is the copy number of plasmid standard DNA (copies·μL-1)圖3 雙重熒光定量PCR對低濃度質粒標準品的擴增曲線圖Fig.3 The detection limits of duplex RT-PCR for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

我們將3次不同時間點對質粒標準品的重復檢測結果繪制成誤差限圖(圖4)，顯示5個質粒標準品檢測Ct值的標準差都在0.06～0.24，3次檢測組內變異系數在0.24%～1.19%間，組間的變異系數在0.39%～0.97%，穩定性極高。

2.4 臨床樣品檢測

對67份臨床樣品進行雙重熒光定量PCR和常規PCR檢測，結果如表3所示，雙重熒光定量PCR總共檢出53例(79.1%)豬鏈球菌通用型陽性樣品和24例(35.8%)豬鏈球菌2型陽性樣品；并且豬鏈球菌2型陽性樣品的通用型檢測也都為陽性，占豬鏈球菌陽性樣品的45.3%。對兩PCR方法結果進行對比，顯示定量結果中模板量大于等于100拷貝數的樣品普通PCR結果都為陽性，模板量為0拷貝數的樣品普通PCR都為陰性，兩個范圍內兩方法的結果符合率為100%。而定量結果為1～100拷貝數的樣品中，兩方法通用型和2型的符合率分別為54.5%和50%，其中5例通用型(樣品和拷貝數分別為鼻拭子7、14、15號：53、18、73，關節液1號：10，肺組織5號：66)和7例2型(樣品和拷貝數分別為鼻拭子3、6、7、8、15號：7、24、13、13、77，關節液1號：9，肺組織5號：63)樣品普通PCR為陰性，分別占熒光定量PCR通用型和2型陽性樣品的9.4%和29.2%，另外6例通用型和7例2型樣品普通PCR為陽性，其中最低拷貝數為通用型的35和2型的19。綜合統計分析顯示雙重熒光定量PCR方法與通用型和2型普通PCR方法的符合率分別為92.5%和89.6%，kappa值分別為0.800和0.757，具有較高的一致性。以常規PCR結果為參考繪制ROC曲線(圖5)，顯示雙重熒光定量PCR方法通用型和2型的曲線下面積分別為0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，檢測Ct值最佳的陽性閾值分別為35和38；在這個閾值下，雙重熒光定量PCR對豬鏈球菌通用型檢測敏感度和特異度分別為89.6%和94.7%，對豬鏈球菌2型的敏感度和特異度分別為100%和94%(箭頭所指)。

右上角表格為各濃度質粒標準品3次重復檢測的批內和批間變異系數Intra-and inter-assay CV of three repeated detection for different concentration plasmid was shown in the table of the top right corner圖4 雙重熒光定量PCR對質粒標準品重復檢測所得Ct值的誤差限圖Fig.4 The error bar of repeatability assay for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

表3 雙重熒光定量PCR與常規PCR對67份臨床樣品的檢測結果

Table 3 Results of duplex real-time PCR and conventional PCR for clinical samples

熒光定量PCRRT-PCR普通PCRConventionalPCR豬鏈球菌S.suis豬鏈球菌2型S.suistype2樣品類型Sampletype模板量(拷貝數/反應)Thequantityoftemplate(copies/reaction)+-+-鼻拭子Nasalswab≥100100001～100231500009關節液Articularfluid≥10010001～100111100203扁桃體Tonsil≥10050301～100002000000肺組織Lungtissue≥100260701～10031310012031總計Total≥1004201001～10065770014043

以熒光定量PCR檢測Ct值為檢驗變量，常規PCR檢測結果為狀態變量繪制ROC曲線。AUV表示曲線下面積，大于9時說明檢測方法具有很高的診斷價值，P<0.001說明診斷成立。最佳閾值是采用曲線上Youden指數最大點(Youden指數=敏感度+特異度-1)，圖上箭頭所指點The Ct value of duplex Real-Time PCR was test variable, Ct value of conventional PCR was state variable, ROC was drawn according to them. AUV mean area under curve.Detection prompted high diagnostic value when AUV was above 9, P<0.001 indicated diagnosis was established.The best positive threshold was Youden index (specificity+sensitivity-1) maximum points on curve, as the arrow in Figure 5圖5 以普通PCR檢測結果為參照繪制雙重熒光定量PCR檢測臨床樣品結果的ROC曲線Fig.5 The receiver operating characteristic curve of duplex real-time PCR detection results for clinical samples which reference to conventional PCR

3 討 論

豬鏈球菌是豬上呼吸道系統中的正常寄生菌，其致病性的劃分比較模糊，部分菌株感染不引起臨床癥狀，或者輕微的發熱或敗血癥；但另外一些毒株可侵入腦、心、肺等主要器官，引發大量的炎癥反應甚至休克性死亡[28]。現有證據表明，1～9和14型對豬具有致病性[3]，而2、4、5、14、16、21、24型可感染人類引起臨床癥狀[1]；其中豬鏈球菌2型是毒力最強，并且分離頻率最高的致病株，占全球報道的豬和人臨床病例數的27.9%和74.7%[1, 3, 8]，在北美、南美、歐洲、亞洲、澳大利亞等地區都是流行率最高的血清型[1,11-12, 29-32]。在我們的臨床樣品調查中也顯示豬鏈球菌2型占豬鏈球菌陽性樣品的45.3%，比例較高。所以在豬鏈球菌的疫情監測中，豬鏈球菌2型應設為重點監測對象。

豬鏈球菌病的初步診斷一般是根據臨床癥狀、接觸史和可視病理變化，確診需要通過分離鑒定出病原菌。細菌分離培養與血清型分型是目前全球實驗室普遍使用的診斷方法，其可靠性已得到研究者的認可；但像大部分細菌一樣，豬鏈球菌的分離培養同樣存在靈敏度低、實驗時間長、操作要求高等缺點，所以越來越多的學者開始關注豬鏈球菌的基因分型鑒定。包括針對型特異性的莢膜多糖基因序列設計分型PCR，這部分研究大多集中在主要致病菌上，但最近有學者針對33個血清型(不包括32和34型)的cps基因設計了多個多重PCR[16,18]，建立全套的基因分型方法；當然現在使用最多的還是針對豬鏈球菌多個保守基因的MLST方法[24]，此方法主要檢測cpn60、dpr、recA、aroA、thrA、gki、mutS等7個保守基因，根據這7個基因的基因型進行編碼確定豬鏈球菌的血清型(ST)，研究者還收集這些數據建立了MLST數據庫，以方便豬鏈球菌的全球流行和分布情況的調查。

不過這兩個基因分型方法都比較費時費錢，而且交叉污染的風險大，只能針對少量樣品；而我們建立的雙熒光定量PCR方法可以在1.5 h內完成對大量樣品的處理和檢測，全程閉管操作，并在監測豬鏈球菌通用型的同時可以完成對重點監測對象豬鏈球菌2型的篩選，與其他單熒光檢測方法相比更省錢省時；而且檢測結果與常規PCR方法的符合率達到92.5%和89.6%，kappa值達到0.800和0.757，模板在普通PCR靈敏度范圍內的樣品兩方法檢測結果符合率甚至達到100%，具有極高的一致性。當然，也和其他PCR方法一樣，我們的方法無法區分2型和1/2嵌合型，因為這兩種血清型的CPS基因非常相似，目前只能根據標準血清進行區分[33-34]。

在這次研究中，我們首先確定了雙重熒光定量PCR的最優反應條件，并構建了兩個靶基因的質粒標準品DNA；隨后在最優條件下對標準品DNA進行檢測并繪制了標準曲線，顯示兩個靶基因的檢測結果和原始模板量都具有極高的線性相關性，相關系數均可達到0.999，擴增效率可達100%左右；并在多次的重復檢測中保持著高度的穩定性，檢測結果的標準差和變異系數分別低于0.24和1.19%；以細菌基因組DNA代替質粒標準品DNA為模板的檢測結果同樣可保持在這個水平(數據未顯示)。

雖然我們無法收集齊35個豬鏈球菌血清型，但我們對主要的致病性血清型特別是2型進行了檢測，顯示雙重熒光定量PCR方法可特異性識別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，兩靶基因之間無交叉反應，并對其他鏈球菌或呼吸系統細菌無非特異性反應。在保持高特異性的同時，本方法的檢測極限可達到5 拷貝數，遠低于常規PCR方法，這也使得在對臨床樣品的檢測中，雙重熒光定量PCR具有更高的檢出率。不過為了保證臨床應用的特異性，我們以普通PCR方法為參照繪制ROC曲線，顯示雙重熒光定量PCR方法的曲線下面積達到0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，說明本方法具有很高的診斷價值；在最佳閾值下，雙重熒光定量PCR檢測豬鏈球菌的靈敏度和特異度達到89.6%和94.7%，檢測豬鏈球菌2型的靈敏度和特異度達到100%和94%，基本滿足臨床樣品檢測對靈敏度和特異度的要求。

成功建立了一種靈敏、特異和穩定的雙重熒光定量PCR方法，可同時及快速診斷豬鏈球菌和2型豬鏈球菌，非常適合大量臨床樣品的檢測。但我們的研究也顯示，在拷貝數低于普通PCR靈敏度的模板樣品中，兩方法的符合率只有54.5%和50%，這可能與普通PCR靈敏度低，容易出現假陰性有關，但也不能排除熒光定量PCR出現假陽性可能。要解決這一問題需要我們在下一步的研究中收集更多的臨床樣品進行平行檢測，并引入第三種檢測方法進行對比，探求熒光定量PCR方法在臨床應用中Ct值的最佳陽性閾值，以獲得最高靈敏度及特異度的平衡點。

4 結 論

成功建立靈敏、特異和穩定的雙重熒光定量PCR方法，實現了豬鏈球菌和2型豬鏈球菌同時及快速診斷，此方法非常適合大量臨床樣品的檢測，可應用于臨床診斷和疫情監控，為診斷和防控豬鏈球菌病提供技術支持。

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