不同保存條件對血中乙醇含量穩定性的影響

楊廣麗 ，李小波 ，孫巖 ，鄧嘉敏 ，楊麗玲 ，周湘君

(1、廣東康怡司法鑒定中心，廣東 東莞 523000；2、廣東金域法醫物證司法鑒定所，廣東 廣州 510000；3、東莞市第五人民醫院，廣東 東莞 523000；4、廣東醫科大學，廣東 東莞 523000)

酒后駕車為交通事故的一大“殺手”[1-3]，長期大量飲酒會造成心、腦、肝、腎、周圍神經的損害，引起酒精中毒、出現幻覺、人格障礙等精神癥狀[4]。新《交通法》的實施使酒駕檢測更日漸普遍[5，6]，而最能反映是否酒駕的標準是血液乙醇含量，因此實驗室檢測的結果是否準確，關系到司法判定的正確性及公正性。由于乙醇具有很強的揮發性，血樣檢測應當越快越好。但在實際檢案中，由于肇事現場的各種復雜因素導致樣本送檢被延誤或保存不當，或樣本存放一段時期后因案件需要須復檢的，故對于樣本的檢測時機、保存方式以及復檢時反復凍融等因素是否會引起乙醇含量改變而影響司法判定，筆者仍存在困惑。為保證檢測結果的準確性，對樣本中乙醇含量的穩定性研究是非常有必要的。由于樣本的保存溫度一直存在爭議[7，8]，而關于光照和解凍時間是否會影響乙醇含量穩定性目前尚未有文獻報道，筆者意在通過檢測不同保存方式（溫度、時間、光照以及解凍時長）下乙醇的含量變化情況以確定影響其穩定性的因素，為樣本的保存方式提供參考依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 空白溶液 空白血液。

1．1．2 叔丁醇內標溶液 精密稱取叔丁醇2．5126g于500ml容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得叔丁醇內標儲備液；精密量取叔丁醇內標儲備液8．0ml于1000ml容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，作為叔丁醇內標溶液。

1．1．3 對照品溶液 乙醇標準品（Cerilliant Corporation，濃度：10mg/100ml、20mg/100ml、50mg/100ml、80mg/100ml、100mg/100ml、200mg/100ml、300mg/100ml）。

1．1．4 供試品溶液 精密稱取無水乙醇 0．2002g于250ml容量瓶中，用空白血液定容至刻度，搖勻，得80mg/100ml乙醇供試品溶液。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器 Agilent 7890A氣相色譜儀，附 FID檢測器 （安捷倫科技有限公司）；Agilent 7694E自動頂空進樣器（安捷倫科技有限公司）；QL-500氫氣發生器（山東賽克賽斯氫能源有限公司）；AG系列空氣發生器（濟南格潤實驗儀器有限公司）；Sartorius BS124S電子天平 （德國賽多利斯集團）；PURELAB Ultra超純水儀（威立雅水處理技術有限公司）；硅橡膠墊 （安捷倫科技有限公司，批號：00230064）；鋁帽 （安捷倫科技有限公司，批號：0000970929）。

1．2．2 試劑 無水乙醇、叔丁醇 （色譜純，純度≥99．9%）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇 標 準 品 （10mg/100ml、20mg/100ml、50mg/100ml、80mg/100ml、100mg/100ml、200mg/100ml、300mg/100ml）購自 Cerilliant Corporation；超純水(18．2MΩ)由超純水儀(PureSure純水系統)制備。

1．3 方法

1．3．1 色譜條件 色譜柱 DB-624 （30m×0．32mm×1．8um 柱），柱溫 40℃，進樣口溫度 150℃，檢測器溫度250℃，氮氣流量25ml/min，氫氣流量30ml/min，空氣流量300ml/min。

1．3．2 頂空自動進樣條件 頂空瓶預熱溫度70℃，定量環溫度80℃，傳輸線溫度90℃，循環時間1．0min，頂空瓶加熱平衡時間 6．0min，頂空瓶加壓時間 0．20min，定量圈定量時間 0．20min，定量圈平衡時間 0．05min，進樣時間 1．00min。

1．3．3 專屬性實驗 分別精密移取叔丁醇內標溶液0．50ml于 3 個 10ml頂空進樣瓶中，依次加入“1．1”項下空白溶液、80mg/100ml乙醇對照品溶液及供試品溶液0．10ml，加蓋密封，按上述實驗條件測定。

1．3．4 重復性實驗 分別精密移取叔丁醇內標溶液0．50ml于6個10ml頂空進樣瓶中，依次加入供試品溶液0．10ml，密封，按上述實驗條件測定。

1．3．5 氣密性實驗 分別精密移取叔丁醇內標溶液0．50ml于60個10ml頂空進樣瓶中，依次加入供試品溶液0．10ml，硅橡膠墊和鋁帽密封，輕緩搖勻， 在室溫的條件下分別放 置 0．0h、0．5h、1．0h、1．5h、2．0h、2．5h、3．0h、3．5h、4．0h、4．5h、5．0h、6．0h、7．0h、8．0h 和 9．0h 后再進樣，每個時間點做 3 個平行樣，監測其含量的變化情況。

1．3．6 光照實驗 在室溫條件下分別取供試品溶液5．0ml置于2個5ml的容量瓶中，分為光照組和避光組，同法操作，每隔2h頂空進樣，每個時間點做3個平行樣，記錄8h之內乙醇含量的變化情況。

1．3．7 不同保存溫度和保存時長實驗 分別取供試品溶液1．0ml于90個1．5ml的離心管中，將這90個離心管隨機分成3組，每組30個，分別在室溫（24-28℃）、冷藏（4℃）和冷凍（-20℃）條件下保存30d，各組每天檢測一個樣本，每個樣本做3個平行樣，冷凍樣本至少冷凍24h，且做樣前要提前解凍，記錄各樣本含量的變化情況。

1．3．8 解凍時長實驗 分別取供試品溶液 5．0ml置于6個5ml的容量瓶中，冷凍樣本至少冷凍24h。記錄樣本在室溫條件下自然解凍 0．5h、1．0h、1．5h、2．0h、2．5h、3．0h、3．5h、4．0h、4．5h、5．0h、6．0h、8．0h 和10．0h乙醇含量的變化情況，每個時間點做3個平行樣。

1．4 統計學處理 采用SPSS 20．0統計軟件進行重復測量方差分析和配對t檢驗，結果以均數±標準差表示，P＜0．05 表示差別有統計學意義。多變量方差分析先進行Mauchly的球形度檢驗，若P＜0．001，則采用Huynh-Feldt調整后的F值和P值。

2 結果

2．1 專屬性實驗 由圖1可以看出，在上述條件下，各色譜峰分離度均達基線分離（R＞1．5），且峰形尖銳美觀，無雜峰干擾。根據中華人民共和國公共安全行業標準《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙酮和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗法》（GA/T 1073-2013）[9]中規定，檢材與校準樣或控制樣的保留時間偏差應小于2%。結果表明，該供試品溶液符合要求，由此可確定供試品溶液中含有乙醇成份，乙醇出峰時間為3．5min，叔丁醇出峰時間為5．1min。

2．2 重復性實驗 按上述實驗條件測定，結果表明，其RSD＜2%，重復性良好。

圖1 氣相色譜圖A.空白溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液

2．3 氣密性實驗 對室溫的條件下放置9h內樣本中乙醇含量變化情況進行單方向方差分析，如表1所示，各時間點測量值在統計學上無顯著性差異（P＞0．05），說明室溫條件下硅橡膠墊和鋁帽密封放置9h內氣密性良好。

表1 氣密性實驗（mg/100ml）

2．4 光照實驗 對8h之內光照組和避光組中乙醇含量變化情況進行配對t檢驗分析，結果如表2所示：8h之內光照與否對乙醇含量無影響 （均有P＞0．05）。

2．5 不同保存溫度和保存時長實驗 對30d內室溫組、冷藏組和冷凍組中乙醇含量變化情況進行統計分析，結果見表3。研究結果發現，①整體比較：Mauchly 的球形度檢驗 P＜0．001， 拒絕球形假設，采用H-F調整P值（表3），結果提示不同保存時間點的乙醇含量變化很大，不同保存溫度對乙醇含量也有影響，且時間和溫度之間有交互作用（均有 P＜0．001），其交互效應輪廓圖見圖 2。②不同時間點比較（組內）：各溫度組的不同時間點（1-30天）總體比較發現（表 3），冷凍組30d之內的P=0．25，無統計學差異，說明樣本中乙醇在冷凍時保存穩定；而室溫和冷藏下不同時間點有統計學差異（均有P＜0．001）。將室溫組和冷藏組的不同時間點與初始濃度（第1d）相比，發現室溫組7d內乙醇含量穩定（均有 P＞0．05），第 8d開始隨時間呈下降趨勢（均有 P＜0．05），而冷藏組乙醇含量變化初期相對平緩（19d 內均有 P＞0．05），第 20d 起乙醇含量也隨時間呈下降趨勢（均有 P＜0．05）（圖 2）。③不同保存溫度比較（組間）：各時間點的不同溫度間（室溫、冷藏、冷凍）相互比較結果顯示（表3），各溫度組7d內的P值均大于0．05，在統計學上無顯著性差異，說明7d內溫度對乙醇含量影響很小；而第8d起各溫度組間均有P＜0．05，有統計學差異，表示第8d后乙醇含量在不同保存溫度下變化很大。將第8d后各溫度組兩兩比較發現，8-19d內室溫組含量明顯低于另兩組（均有 P＜0．05），冷藏和冷凍含量無差別（P＞0．05）；20-27d 內含量室溫組＜冷藏組＜冷凍（均有 P＜0．05），28-30d 內室溫組與冷藏組無差別（P＞0．05），冷凍組含量仍然穩定。

表2 光照實驗（mg/100ml）

圖2 保存溫度和時間交互效應輪廓圖

2．6 解凍時長實驗 對室溫條件下自然解凍10．0h之內樣本中乙醇含量變化情況進行單因素重復測量方差分析，如表4所示：冷凍狀態下解凍0．5h時樣本中可見冰塊狀，仍有部分溶液未完全解凍，其乙醇含量與同組最終濃度 （解凍10．0h）相比P＜0．05，解凍1．0h時樣本外壁仍可感覺到明顯的冰凍感，冷凍4組-6組的乙醇含量與同組最終濃度（解凍 10．0h）相比 P＜0．05，而解凍 1．5h 以后樣本中未見冰塊狀且無冷凍感，各時間點間兩兩比較均有P＞0．05，說明樣本在解凍1．5h后乙醇含量相對穩定。

3 討論

3．1 供試品濃度的選擇 李萱等[10]認為當乙醇的初始濃度較高或較低時，對乙醇穩定性影響較大。而80mg/100ml的乙醇濃度是評判酒駕還是醉駕的標準[11，12]，故為選擇具有代表性的初始濃度且又減少初始濃度對其穩定性的影響，本次實驗選擇80mg/100ml乙醇供試品溶液作為樣本。

3．2 氣密性對乙醇含量的影響 乙醇具有揮發性，且易氧化反應生成乙醛[13，14]，因此容器的氣密性可能會引起乙醇含量變化。在實際工作中樣本配制完后經常會存在因樣本數量過多而不能立即檢驗的情況，故本文對此進行了考察，結果發現室溫放置9h乙醇含量無變化，說明硅膠墊和鋁帽在9h之內氣密性良好。

3．3 光照對乙醇含量的影響 采血管一般為無色透明的玻璃管或塑料管，血液采集過程中或樣本送檢過程中避免不了會暴露在光照中，故光照也可能是影響因素之一。本實驗結果顯示8h之內有無光照對乙醇含量無影響，說明8h之內光照與否不是影響乙醇含量穩定性的因素。

3．4 不同保存溫度和保存時長對乙醇含量的影響乙醇容易被微生物污染，在微生物作用下既可新生又可損耗乙醇[15-17]，而微生物的生成受溫度影響較大[18-20]，故溫度是影響樣本乙醇含量穩定性因素之一。實驗結果顯示室溫和冷藏條件下乙醇含量會隨時間而變化，室溫下7d內乙醇含量穩定，冷藏下19d內穩定，而冷凍條件下可穩定保存30d。有文獻報道[21]冷藏樣本存儲14d后乙醇含量出現明顯下降，與本文結果有所出入，考慮可能是由于本實驗初便將同一樣本分裝成90份存放，各組每天檢測一份樣品，不存在反復開瓶凍融情況，從而避免了因開瓶凍融次數過多而導致乙醇含量降低的現象，檢測結果更為全面和接近真實情況。

3．5 解凍時長對乙醇含量的影響 筆者在日常的司法檢測過程中經常會存在樣本需重新鑒定的現象，所以解凍時間的長短對樣本檢測結果也存在影響。研究表明冷凍樣本解凍0．5h時與真實值偏相差較大，解凍1．0h時部分樣本含量與真實值依舊相差較大，而解凍1．5h后乙醇含量接近真實值，考慮可能是1．0h內樣本還沒有完全解凍，乙醇分配不均勻所致。

表3 不同保存條件對樣本中乙醇濃度的影響（mg/100ml）

表4 冷凍樣本（-20℃）在室溫條件下解凍時長對乙醇含量的影響（mg/100ml）

本實驗方法線性良好，校正曲線y=0．0464580x-0．00379693， 相關系數為 0．99998，線性范圍(10-300)mg/100ml，檢測限為 0．51mg/100ml，定量限為1．45mg/100ml，精密度和重復性實驗的RSD均小于2%，為本次實驗的進行奠定了良好的基礎，使檢測結果更為科學。通過在不同的保存溫度、保存時長、有無光照以及不同解凍時長下檢測乙醇的含量變化情況，發現保存溫度、保存時長和解凍時長對乙醇含量影響較大。7d內樣本均可保存在室溫、冷藏和冷凍條件中，19d之內可保存在冷藏和冷凍條件中，而30d之內最佳的保存條件是冷凍，冷凍后的樣本最短解凍時長為1．5h。

[1]劉文龍，郭翊煬，江龍，李常明，陳文斌，王建武．2011-2014年湖南省長沙市長沙縣酒后駕駛交通事故的流行病學調查[J]．中國健康教育，2016，32(9)：811-814．

[2]顏小鑾．江蘇省酒后駕駛現況調查及影響因素研究[D]．東南大學，2015．

[3]顧云．關于酒駕以及其檢測手段[A]．中國法醫學會法醫臨床專業委員會．中國法醫學會·全國第十七屆法醫臨床學學術研討會論文集[C]．中國法醫學會法醫臨床專業委員會：，2014：2．

[4]沈曄，黃衛權．酒精依賴患者血液流變學的變化[J]．實驗與檢驗醫學，2011，29(3)：303．

[5]中華人民共和國道路交通安全法 [N]．人民日報，2011-08-06(006)．

[6]關于檢查《中華人民共和國道路交通安全法》實施情況的報告(節選)[J]．中國應急管理，2017，(1)：68-70．

[7]馬棟，卓先義，卜俊，向平，沈保華．血液中乙醇保存穩定性研究[J]．法醫學雜志，2007，(2)：117-119．

[8]劉曉霞．乙醇在犬體內的死后再分布及保存人血液中穩定性的研究[D]．山西醫科大學，2007．

[9]GA/T 1073-2013，生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙酮和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗法[S]．

[10]李萱，孟祥志．不同保存方法對血液樣本中乙醇濃度的影響[J]．數理醫藥學雜志，2013，26(5)：554-556．

[11]黃勇．酒駕和醉駕酒精含量判斷標準[A]．中國法醫學會法醫臨床專業委員會．法醫臨床學專業理論與實踐——中國法醫學會·全國第十八屆法醫臨床學學術研討會論文集 [C]．中國法醫學會法醫臨床專業委員會：，2015：1．

[12]GB19522-2010．車輛駕駛人員血液、呼氣酒精含量閾值與檢驗[S]．

[13]王陽．金—銅雙金屬催化劑催化乙醇氧化脫氫制乙醛的研究[D]．大連理工大學，2016．

[14]鐘儉鴻，殷瑜，陳代杰．乙醇誘導對鼠李糖乳桿菌HCCB 20591代謝乙醛的影響[J]．生物技術通報，2017，33(7)：133-137．

[15]卓先義，卜俊，向平，沈保華，陳聰．血液中乙醇檢測結果的法醫學分析[J]．中國司法鑒定，2010，(1)：22-25．

[16]孫蓉．一株硫代雙乙醇降解菌遺傳學特征及降解性能的研究[D]．云南大學，2012．

[17]萬思諾(Cristiano Varrone)．微生物混合菌群促進粗甘油生物轉化同步產氫產乙醇工藝[D]．哈爾濱工業大學，2015．

[18]黃光照．法醫毒理學[M]．北京：人民衛生出版社，2004，109-115．

[19]吳靜．有機物料、氮肥添加及溫度對土壤微生物呼吸的影響[D]．南京信息工程大學，2016．

[20]范分良，黃平容，唐勇軍，李兆君，梁永超．微生物群落對土壤微生物呼吸速率及其溫度敏感性的影響 [J]．環境科學，2012，33(3)：932-937．

[21]杜娟．血液中乙醇含量檢測結果的影響因素及質量控制研究[D]．南方醫科大學，2015．