奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的制備及穩定性評價

文/周慶民 徐 馨* 馮萬宇 張 艷 寧秀云

（1 黑龍江省獸醫科學研究所；2 訥河市動物防疫站）

奶牛乳房炎是目前奶牛養殖業中危害最嚴重、造成損失最大的疾病之一[1～3]，嚴重阻礙奶牛業健康發展，危及人類食品安全[4～6]。奶牛乳房炎發病率高，發生范圍廣泛[7～9]。奶牛乳房炎發病初期，臨床癥狀不明顯，眼觀無法判斷[10～12]，但乳汁中體細胞增多，通過對乳汁中體細胞數的檢測可以診斷奶牛乳房炎是否發生，做到早期發現，及時治療[13，14]。多年以來，對奶牛乳房炎早期診斷研究很多[15～21]，相應研究出來很多方法，但都存在不足，為了更準確、更快速、更方便地診斷出早期奶牛乳房炎，進行了深入詳細的研究，研制了奶牛乳房炎早期診斷試劑盒，并對其穩定性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：乳汁采自齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地。

試劑：甲基綠（購自廣州威佳科技有限公司）、碘化鉀（購自濟南嘉裕化工有限公司）、冰醋酸（購自天津市恒興化學試劑制造有限公司）、醋酸鈉（購自南方醫科大學試劑中心）。

1.2 試劑盒的制備

1.2.1 裂解液的制備

配置5 mol/L的碘化鉀（KI）溶液作為細胞裂解液，直接、快速裂解體細胞及其核膜，釋放DNA。

1.2.2 染色液的制備

醋酸鹽緩沖液（pH值4.8）：取冰醋酸2.4 mL，醋酸鈉8.16 g，溶解于498 mL蒸餾水，配置成0.2 mol/L的醋酸鹽緩沖液。

甲基綠染色液的制備：取上述醋酸鹽緩沖液400 mL，加入精密稱取的甲基綠粉末8 g，充分溶解，配置成2%甲基綠染色液。

1.2.3 檢測方法

以移液槍吸取待檢奶牛乳汁樣品50 μL，加入100 μL KI裂解液，靜置2 min后加入甲基綠染色液，3 min后比對比色卡，根據待檢樣品顏色判定奶牛體細胞數目。

1.2.4 判斷結果

依照1.2.3檢測方法操作后，對乳樣進行結果判定，判定結果見表1。

1.2.5 試劑盒的保存期檢測

將同一批次制備的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒39 個，各取半數分別置于4 ℃和室溫狀態下保存，每月分別取1 個試劑盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強陽性（+++）乳汁樣品進行判定，以確定試劑盒的最佳保存條件和保存期限。

1.2.6 試劑盒的可重復性（穩定性）試驗

取8 種不同批次（批號分別為160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911）的密閉試劑盒各兩盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強陽性（+++）乳汁樣品進行檢測，驗證同批次（批內）和不同批次（批間）制備的試劑盒判定的試驗結果是否具有可重復性（穩定性）。

表1 判定結果

表2 保存期檢測試驗結果

2 結果與分析

2.1 保存期檢測試驗結果

試驗的0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 天分別取同一批次同時保存的密封試劑盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強陽性（+++）乳汁樣品進行檢測，判定的試驗結果與已知陰性、陽性比對，結果見表2。由表可知，無論室溫還是4℃保存的試劑盒360 天內試驗結果準確，故而保質期定為1 年。

2.2 穩定性檢測試驗結果

取批次160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911的密閉試劑盒各兩盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強陽性（+++）乳汁樣品進行檢測，判定的試驗結果與已知陰性、陽性比對，結果見表3。由表可知，無論相同批次還是不同批次的試劑盒保質期內試驗結果均準確，說明該試劑盒檢測結果可重復，試劑盒穩定性較高。

3 討論

3.1 甲基綠對DNA能夠染色，其染色后顯色的程度反映出DNA的量，DNA的量又反映出乳汁中體細胞的數量，乳汁中體細胞的數量又反映出奶牛乳房炎發生的程度，因此，本試驗甲基綠染色的顏色也會由淺到深變化，這樣可以根據顏色變化程度而判斷乳汁中體細胞數量范圍，以及奶牛乳房炎發生程度。

3.2 KI溶液是一種常用化學試劑，很穩定；甲基綠在醋酸鹽緩沖液作用下，也十分穩定，因此，這兩種診斷液可長時間保存并保持穩定，其對奶牛乳汁中體細胞的DNA作用穩定，在4 ℃或室溫狀態下長期保存判斷結果一致。

4 結論

奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的制備原理，是以KI裂解乳汁中體細胞細胞膜及其核膜，釋放出DNA，然后利用甲基綠染料對DNA進行染色，通過染色后顯色的綠色深淺正反饋DNA含量的多少，從而反映乳汁中體細胞數量的多少，進而快速判定出奶牛乳房炎發生的程度。

表3 穩定性檢測試驗結果（n=2）

試劑盒操作簡便、判定迅速，5 min即可判斷出結果；便于攜帶和現場應用，為檢測和防控乳房炎提供了一種新的方法和手段。另外，該試劑盒保質期長，穩定性好。通過4 ℃和常溫條件下的長期保存，證實該試劑盒判定結果與已知樣品一致，且4 ℃和常溫下均可保質1 年以上。

以碘化鉀法直接裂解體細胞DNA，快速、簡便、經濟、高效。但應注意裂解后必須及時染色和判定，因為時間過長會容易引起DNA降解。因此裂解后要及時染色和判定，避免時間過長影響試驗結果，導致樣品染色顏色偏淺，造成假陰性和嚴重程度誤判。

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