人乳頭瘤病毒分型檢測方法學(xué)性能評價

王益松，仲崇明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院，江蘇 連云港222004)

宮頸細胞學(xué)檢查已普遍應(yīng)用于宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的篩查，可發(fā)現(xiàn)早期病變[1，2]。傳統(tǒng)巴氏涂片宮頸細胞學(xué)檢查存在其固有的局限性[3，4]。高危型HPV核酸檢測用于宮頸細胞學(xué)檢查異常患者的分流及宮頸癌篩查，可有效地增加宮頸癌病變檢出率，提高細胞學(xué)檢查的敏感性和準確性，并降低篩查頻率或避免過度醫(yī)療。目前，HPV核酸檢測技術(shù)很多[5，6]，但無統(tǒng)一標(biāo)準。確立良好的性能指標(biāo)并充分理解HPV檢測臨床意義，對試劑產(chǎn)品方法學(xué)分析性能及臨床性能評價至關(guān)重要。本文參照《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理局，2015年11月26日發(fā)布），針對本實驗室開展HPV-21分型檢測所使用試劑產(chǎn)品作方法學(xué)分析性能評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HPV-21分型檢測試劑：潮州凱普生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品；PCR擴增儀：型號為TL-988，為西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；導(dǎo)流雜交儀：型號為HHM-2，為廣東凱普生物科技股份有限公司產(chǎn)品。HC2二代雜交捕獲方法儀器型號為DML2000，為凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司，試劑為凱杰配套產(chǎn)品。

陽性參考品：批號20170101；A組質(zhì)粒型別為HPV 6、44、18、33、52、66、CP8304；B 組質(zhì)粒型別為HPV 11、43、31、45、56、58、68；C 組 質(zhì) 粒 型 別 為HPV 16、35、39、51、53、59；D 組質(zhì) 粒 型別為 HPV 42；E 組質(zhì)粒型別為 HPV 26、54、72、84；HPV 陰性參考細胞系。陽性、陰性參考品均為潮州凱普生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.2 評價指標(biāo) 準確性、交叉反應(yīng)、特異性、檢測限、重復(fù)性、干擾。

1.3 方法 準確性：對A、B、C、D組質(zhì)粒參考品，加樣1μl，按程序擴增，按程序雜交，觀察陽性符合率；交叉反應(yīng)：E組質(zhì)粒加樣1μl，按程序擴增，按程序雜交，觀察陰性符合率；特異性：HPV陰性參考細胞系按正常程序提取DNA，正常程序擴增、雜交，觀察陰性符合率；檢測限：A、B、C、D組質(zhì)粒參考品作2倍、5倍稀釋，每管重復(fù)5次，各加樣1μl，按程序擴增、雜交，觀察陽性符合率；重復(fù)性：隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復(fù)2次檢測，觀察陽性符合率；干擾：設(shè)定紅細胞、白細胞、異丙醇為干擾因素。在提取后擴增樣本中分別加入不同量值異丙醇，正常程序擴增、雜交，觀察陽性符合率，以判斷異丙醇干擾性；取紅細胞、白細胞含量較多，以HC2（二代雜交捕獲）方法檢測結(jié)果為HPV16、HPV18陽性樣本各10例，并以HPV-21分型檢測試劑（潮州凱普生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品）檢測，觀察陽性符合率，以判斷紅細胞、白細胞干擾性。

2 結(jié)果

2.1 準確性 A、B、C、D組質(zhì)粒共包含高危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68， 低危型 HPV 6、11、42、43、44、CP8304， 共 21 HPV分型。檢測結(jié)果均顯陽性，“IC”點顯色正常（擴增質(zhì)控點），“Biotin”點顯示正常（顯色質(zhì)控點），陽性符合率100%。

2.2 交叉反應(yīng) E組質(zhì)粒型別為 HPV 26、54、72、84，本實驗室開展HPV-21分型試劑外HPV型別。實驗結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。

2.3 特異性 HPV陰性參考細胞系實驗結(jié)果為HPV21型別均顯陰性，符合產(chǎn)品要求。

2.4 檢測限 A、B、C、D組質(zhì)粒參考品濃度均為350拷貝/μl，當(dāng)2倍或5倍稀釋后，5管重復(fù)檢測結(jié)果均有陰性；350拷貝/μl濃度，各型別5管重復(fù)均顯示陽性。實驗結(jié)果顯示試劑產(chǎn)品檢測限為350拷貝/μl。

2.5 重復(fù)性 隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復(fù)2次檢測，2次重復(fù)檢測結(jié)果一致。

2.6 干擾 紅細胞、白細胞含量較多樣本，以HC2（二代雜交捕獲）方法檢測結(jié)果與HPV-21分型檢測試劑（潮州凱普生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品）檢測，陽性符合率 100%；10μl異丙醇加入后，“IC點”（擴增質(zhì)控點）和HPV陽性樣本無陽性反應(yīng)。

3 討論

研究[7，8]顯示在已知100多種HPV型別中，有30多種型別在宮頸癌中被檢測到。HPV分型檢測要求：不同基因型別，要有特異的引物和探針；在HPV核酸檢測試劑盒設(shè)計時，要求考慮到HPV檢測限與特異度之間的平衡，避免產(chǎn)生交叉反應(yīng)；國內(nèi)試劑盒設(shè)計時，不僅要參考國外文獻報道的HPV基因型別，還要考慮到國內(nèi)流行的HPV型別；對試劑盒質(zhì)量監(jiān)測需有內(nèi)標(biāo)設(shè)計及對實驗操作有質(zhì)量控制要求[9]。目前，國內(nèi)HPV核酸檢測（分型檢測）已廣泛開展，但方法學(xué)（試劑）多樣[10，11]。 目前 HPV 檢測試劑國產(chǎn)與進口均有使用。國外進口主要以PCR熒光探針和酶切信號放大方法為主，約有5家生產(chǎn)企業(yè)。國產(chǎn)HPV檢測試劑生產(chǎn)廠家近15家，40多種產(chǎn)品[12]。方法學(xué)準確性和可靠性不一，尚無統(tǒng)一標(biāo)準化。在尚沒有標(biāo)準化的情況下，各種方法學(xué)性能評價對保證檢測結(jié)果準確性、可靠性尤顯重要。

本文參照《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理局，2015年11月26日發(fā)布），針對本實驗室開展HPV-21分型檢測所使用試劑產(chǎn)品作方法學(xué)分析性能評價。結(jié)果顯示：1準確性：21型別陽性檢出率100%，“IC”點顯色正常 （擴增質(zhì)控點），“Biotin”點顯示正常（顯色質(zhì)控點）；2 交叉反應(yīng) 試劑檢測21分型之外4個分型 （HPV 26、54、72、84）實驗結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)；3檢測限實驗結(jié)果顯示試劑產(chǎn)品檢測限為350拷貝/μl；4重復(fù)性 隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復(fù)2次檢測，2次重復(fù)檢測結(jié)果一致；5干擾 紅細胞濃度大于0.758×1012/L時，加入白細胞濃度大于18.3×109/L時，異丙醇多于 10μl時，對 HPV 陽性樣本有干擾。結(jié)果提示本實驗室使用HPV-21分型檢測試劑產(chǎn)品性能（準確性、交叉反應(yīng)在、檢測限、重復(fù)性）符合該產(chǎn)品性能指標(biāo)要求，符合《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》分析性能評估指標(biāo)要求；高濃度紅細胞、高濃度白細胞，異丙醇殘留量較多可干擾HPV陽性檢測。持續(xù)高危型HPV感染是誘發(fā)子宮頸癌重要原因，目前HPV檢測已廣泛應(yīng)用于臨床[13-16]，注重HPV檢測方法學(xué)性能評價，是臨床應(yīng)用的保證，對臨床應(yīng)用有著重要的作用和價值。

[1]Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of wouldwide burden of cancer in 2008：Clobocan 2008[J].Int J Cancer，2010，127(12)：2893-2917.

[2]黃秀珍，姚心韻，陳文學(xué)，等.人乳頭瘤病毒基因型與宮頸癌病變的相關(guān)分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015，33(1)：34-42.

[3]Wright TC Jr.Cervical cancal screening in the 21 stcentury：is it time to retire the PAP smear?[J].Clin Obstet Gynecol，2007，50(2)：313-323.

[4]Nanda K，McCrory DC，Myers ER，et al.Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities ：a systematic review [J].Ann Intem Med，2000，132(10)：810-819.

[5]吳文湘，劉朝暉.62種人乳頭瘤病毒臨床檢測技術(shù)點評[J].中國計劃生育和婦產(chǎn)科，2016，8(9)：1-3.

[6]溫旺榮，李莉.HPV基因檢測技術(shù)新進展[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，38(8)：514-516.

[7]Munoz N，Bosch FX，Castellsague X，et al.Against which human apillomavirus types shall we vaccinate and screen?The international perspective[J].Int J Cancer，2004，111(2)：278-285.

[8]于曉紅，吳斌，葉璐，等.HPV檢測在宮頸腺癌不同亞型中的臨床分析[J].江西醫(yī)藥 2017，52(12)：990-992，999.

[9]王雪亮，劉芬，蔣玲麗，等.人乳頭瘤病毒16型和18型核酸檢測用質(zhì)控品制備及其應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志，2016，34(1)：56-59.

[10]陳文學(xué)，鄒學(xué)森，黃秀珍，等.兩種用于人乳頭瘤病毒檢測方法的比較分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2016，34(3)：291-293.

[11]李源，向陽.HPV感染檢測方法及相關(guān)問題[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2015，34(6)：457-461.

[12]孫楠，王玉梅，劉艷，等.2013年度人乳關(guān)瘤病毒（HPV）檢測試劑盒抽驗質(zhì)量分析[J].藥物分析雜志，2014，34(10)：1807-1811.

[13]孔令和，柯云霞，高素香，等.1312例婦女人乳頭瘤病毒（HPV）感染狀況及其亞型分布情況調(diào)查[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，32(6)：780-182.

[14]董玉蘭，徐冉，陳龍山，等.3394例女性患者宮頸癌人乳頭瘤病毒基因分型及臨床意義[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，32(4)：440-441.

[15]幸瓊，幸情.HR-HPV與TCT篩查宮頸癌及其癌前病變的臨床價值[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2016，34(6)：761-763.

[16]黃艷紅，陳玲，孫飛，等.徐州地區(qū)1216例門診婦女HPV時實熒光定量PCR檢測分析 [J].囯際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，38(16)：2306-2307.