新型小分子納米抗體藥物與靶向治療的研究進展＊

吳 鵬，武 文

抗體藥物在生物及醫學領域中用途最廣泛。1975年和Milstein建立了B淋巴細胞雜交瘤技術，獲得針對單一抗原決定簇的高特異性抗體，這是抗體產生的重大技術革命，該技術使人類通過細胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體（monoclone antibody，McAb）［1］。 單克隆抗體在醫學和生物學的基礎研究及臨床疾病的診斷和治療起到了里程碑的作用。但是，抗體的導向療法尚存在著較大的困難：（1）抗體在機體免疫原性大：鼠源抗體，常會誘導人抗鼠抗體的免疫應答；（2）難以獲得所需特異性的免疫球蛋白的特定亞類：完整的大分子抗體不一定能到達作用部位，抗體恒定區的其他功能會引起一些不良反應；（3）人的雜交瘤制備較為困難，直接用人的單克隆抗體治療疾病尚難開展。

隨著分子生物學技術日新月異的發展，一種來源于自然界存在的，通過基因工程研究結合納米技術研發的納米抗體，因具有相對分子質量小、易于表達、在血液中半衰期相對較短、穿透力強、免疫原性弱等特點，在抗腫瘤、抗病毒等領域具有廣闊前景。

1 納米抗體簡介

納米抗體是生物醫學科學家在傳統抗體的基礎上，運用分子生物學技術結合納米粒子科學的概念，從而研發出的最新和最小的抗體分子［2］。1993年，Hamers-Cazterman 等［3］在單峰駝以及雙峰的亞洲駝和南美駱駝的血清中發現一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（HCAb），克隆重鏈抗體的可變區得到只由一個重鏈可變區組成的單域抗體，稱為VHH抗體 （variable domain of heavy chain of heavychain antibody），其晶體結構呈橢圓形，直徑2.5 nm，長4 nm，是最小的功能性抗原結合片段，又被稱為納米抗體（Nanobody）［4］。

1.1 納米抗體的結構特征駱駝重鏈抗體可變區的納米抗體（VHH），其分子質量為15KDa，遠遠小于 Fab 段（60 KDa）和普通抗體（150 KDa）［5］。存在于羊駝體內天然重鏈抗體的分子結構為：鉸鏈區形成的鏈間二硫鍵連接兩條完全相同的重鏈，每條重鏈分子有一個獨特的重鏈可變區（VhH）、一個鉸鏈區和CH2、CH3兩個恒定區。在IgG的重鏈分子中，恒定區CH1是與輕鏈經鏈間二硫鍵相連的部位，CH1在重鏈抗體的基因組中也存在，但在其mRNA形成過程中被剪切，形成沒有輕鏈和CH1區的駱駝重鏈抗體［6］。

駱駝重鏈抗體的VHH和人抗體重鏈的VH結構非常相似［7］，大概有75%的同源性，包含了三個高變區（CDRs）和其兩側的四個骨架區（FRs），由于輕鏈缺失，納米抗體僅有3個CDRs區，雖然與普通抗體的6個CDRs區相比，納米抗體缺少3個CDRs區，但其具備了相當特異的結合能力和親和力。因為納米抗體的CDR3含有16~18個氨基酸殘基，比人和鼠的VH分別有12和9個氨基酸殘基的CDR3長，這使得納米抗體識別罕見的、隱藏的抗原表位，結合蛋白質、酶抗原的凹陷部位和活性位點成為可能［8］，并且納米抗體的CDR3區域可形成一個大的暴露的凸環，凸環中的一個半胱氨酸與CDR1或FR2的45位點的半胱氨酸形成二硫鍵［9］，可使其生物結構相對穩定，從而大大降低納米抗體與抗原結合所需能量［10］，可獲得高親和力的納米抗體。另外，在一般抗體 VH 的 FR2中，V37，G44，L45和 W47這4個氨基酸殘基參與VL的相互作用，而在重鏈抗體的VHH基因序列中，這4個氨基酸殘基分別突變為 F（Y）37，E44，R45，G47，由疏水性變成了親水性，這樣大大增加了納米抗體的溶解性［11］。

1.2 納米抗體的獨特優勢

1.2.1 結構簡單，易于純化和表達 納米抗體在化學構成及分子量等方面比普通抗體要簡單并且小得多，使用基因工程方法可使納米由單一的基因編碼，并能在原核及真核細胞中高效表達和純化。重組納米抗體通常在E coli中表達量為10 ms/L［12］。納米抗體結構簡單，便于進行基因、分子操作和改造，易進行藥物研發和縮短藥物的研發周期。

1.2.2 親和力及穩定性高 雖然納米抗體缺少輕鏈，但因抗體的CDR3區可以形成一個大的暴露的凸環，凸環中的二硫鍵使其結構穩定，仍然保持了較高的穩定性。將納米抗體在37℃放置1周或加熱至90℃高溫［13］，再將其放置室溫，仍具有折疊復性［14］、恢復抗原結合能力［15］。 此外，納米抗體的穩定性高，其在通過小鼠的消化道時，仍能保持原有的生物活性，顯示納米抗體具有能抵抗胃腸道蛋白消化酶和耐低 pH 的特性［16，17］。 Zhang 等將從羊駝天然納米抗體噬菌體基因庫中篩選的單域納米抗體改造成為五聚化的抗體，極大地提高了抗體與抗原的親和力［18］。五聚體納米抗體與單價納米抗體相比，熱穩定性以及抗蛋白酶降解的特性都有明顯改善。所以，納米抗體可用于酶的抑制劑［19］、受體的激動劑或拮抗劑［20，21］等。

1.2.3 組織滲透力強 納米抗體，不僅能穿過血管進入組織，且能通過血腦屏障，具有極強的穿透力。Pleiner等用靶向納米造影劑顯像豬血管成形術后的頸動脈，發現受到過度牽拉的那段血管平滑肌回聲顯著增強，而對血管壁內皮信號無明顯影響，該結果有力地證實了納米級造影劑具有穿越血管內皮間隙使血管外靶組織顯像的能力［22］。

1.2.4 免疫原性低，易于人源化改造 由于納米抗體為單域小分子抗體，其因缺失Fc段而不會產生抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，大大降低了產生免疫反應的可能性。另外，納米抗體VHH基因序列與人的VH3序列高度同源，僅有兩個地方存在主要不同：（1）VHH 的 CD3 略長于人的 VH；（2）VHH與人源VH僅有10個氨基酸存在明顯差別，由此可見，納米抗體非常易于改造，并且免疫原性遠低于其他抗體。

1.2.5 無不良反應 納米抗體藥物臨床試用階段無不良反應報告。比利時Ablynx公司的抗急性血栓納米抗體、抗乳腺癌HER-2納米抗體等藥物已完成I期臨床試驗，抗TNF-α、TNF受體的納米抗體藥物已進入到市場前期階段。

2 納米抗體的臨床應用

2.1 納米抗體在實驗診斷中的應用腫瘤的早期診斷和治療效果監控一直是研究者關注的問題。在癌癥的早期診斷中，腫瘤標志物起重要作用，他們的存在和量變可以提示腫瘤的發生組織、細胞分化，可以早期發現和診斷腫瘤。目前，科學家已經成功地分離出針對許多種腫瘤標志物的小分子抗體。MUC1蛋白主要存在于乳腺、胰腺、卵巢等上皮組織和器官中，是由muc1基因表達的一種高糖基化（糖化＞50%）、高分子量（Mr＞200×103）蛋白，在癌變上皮細胞表面高度異常表達。MUC1納米抗體可特異性地識別乳腺及卵巢腫瘤細胞［23］，將標記I131的MUC1抗體注射入荷瘤小鼠體內，可靶向結合乳腺及卵巢腫瘤細胞，充分證明了納米抗體的腫瘤抗原靶標作用。

為了在體內快速而準確地檢測腫瘤所在位置，理想的顯影劑應具備良好的組織滲透性，高抗原親和力，非特異性噪聲背景低，未結合靶抗原的抗體能迅速清除，將放射損傷程度降到最低［24］。Cortez－Retamozo等［25］以單域抗體作為靶向分子構建的顯影劑穿透性好，親和力高，在數小時內腫瘤組織的顯像效果明顯提高，在正常的組織中沒有發現顯影劑的存在。

2.2 納米抗體在免疫治療中的重要作用

2.2.1 納米抗體作為酶抑制劑的應用 納米抗體可做為酶抑制劑，抑制白細胞的胞外酶的活性。Ryutaro等通過人鼻病毒3C（humanrhinovirus 3C，HRV3C）蛋白酶識別位點，將雙特異性雙鏈抗體hEx3－ScDb（以EGFR和CD3為靶點）融合到人Fc區域，合成IgG樣BsAb的抑制腫瘤的效果明顯優于已批準上市的西妥昔單抗。1996年 Desmyter［26］首次制備出抗溶菌酶納米抗體，這種特異性的抗體在后續的各種實驗中都顯示了較高的親和力、穩定性，有效抑制了溶菌酶淀粉樣纖維的形成［27］。用TEM－1及BcII β－內酰胺酶免疫單峰駱駝，可獲得特異性識別此類β－內酰胺酶的納米抗體，有效抑制β－內酰胺酶，使抗生素中的β－內酰胺環免遭水解而失去抗菌活性［28］。 加拿大生物國立研究院［29］將攜帶有Bax特異VHH單域抗體編碼序列的表達載體穩定轉染細胞后，顯示出較強的抗氧化性并明顯降低由H2O2引起的細胞毒性，為退行性病變提供了新的治療靶點。

Ablynx已開發出三株抗老年性癡呆的納米抗體，其中兩株納米抗體能與造成患者大腦淀粉樣病變的淀粉酶的活性位點的邊緣結合，對該酶活性有輕微的抑制，而另一株納米抗體能與酶的活性位點結合，對該酶活性有較強的抑制作用，所有這三種納米抗體將很快進入臨床試驗階段。另外，抗IL－6受體的納米抗體在類風濕關節炎的治療中，取得了理想的效果，為風濕免疫病的治療提供了新思路［30］。

阿昔單抗（abeiximab，ReoPro）［31］，以血小板糖蛋白Ⅱb/Ina為靶點，用以防止血小板聚集及血栓形成，作為冠狀動脈導管插術時預防心肌缺血的輔助用藥，取得了巨大的成功。

Airesdasilva 等［32］將針對 HIV－1 的 Vif蛋白的scFv的VH區進行了特征性改造，發現改造后的抗體在細胞內能有效表達，并具有很好的溶解性，能夠與Vif蛋白結合，中和HIV－1病毒的感染。

2.2.2 納米抗體在感染性疾病治療方面的應用小分子抗體與超抗原的連接成為一個熱點，如T細胞超抗原葡萄球菌腸毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）等。 目前有多個 Fab－SEA融合蛋白正在進行臨床試驗。Serruys［33］制備出5個納米抗體，可特異性的識別乙肝病毒的S蛋白，阻止病毒進入細胞，并證明納米抗體可在體內有效阻止乙肝病毒的分泌?？谔阋呤且环N急性、高傳染性微小RNA病毒，而從美洲駱駝身上獲得的納米抗體可以有效地中和病毒，起到被動免疫的作用［34］。另外，抗脂多糖納米抗體治療內毒素血癥［35］和抗非洲錐蟲病［36］的納米抗體，在體內、體外的試驗中，也取得了較好的治療效果。

2.2.3 納米抗抗體在腫瘤靶向治療中的作用GW572016是一個表皮生長因子受體1（epithelial growth factor receptor，EGFR）和表皮生長因子受體2（Her－2）的雙重抑制劑，其能夠有效抑制EGFR和Her－2過表達細胞的磷酸化，具有抗增殖和放射敏感化的作用。GW572016納米抗體的臨床實驗也正在進行中。納米抗體能選擇性的與人血腦屏障內皮細胞結合，介導藥物、多肽等大分子物質穿過血腦屏障向細胞內轉移，起到了一定的治療作用［37］。將納米抗體直接結合在癌胚抗原和一個細菌B內酰胺酶之間，構建雙功能融合蛋白，能完全治愈LS174T人腺癌異種移植物，而沒有任何不良反應［38］。

總之，納米抗體及其相關技術平臺是抗體工程研究的最前沿技術之一，由于其技術的先進性和獨特性，在抗腫瘤、抗病毒等領域的治療、診斷和醫療保健方面具有十分廣闊的應用前景。

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