豬偽狂犬病病毒診斷與檢測方法研究進展

劉霞 王慧 李照偉/貴州省動物疫病預防控制中心

崔燕/甘肅農業大學動物醫學院

豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬、牛等多種家畜和野生動物的一種急性傳染病，以發熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀（豬除外） 。該病主要引起種豬呼吸系統及生殖系統疾病和仔豬神經系統疾病，成年豬呈隱性感染，仔豬病死率100%。在世界上，已有 40多個國家發生此病，發達國家已將本病列為重點防治疾病之一；在我國，自1947年首次報道后，已有20多個省、市、自治區相繼報道過本病，2012年以來PRV的持續性感染和潛在的免疫抑制，更是給我國豬病防治和疫病凈化工作帶來了很大的困難。國外一些專家認為，全世界由PR造成的損失每年可達幾十億美元，僅低于口蹄疫（FMD）和豬瘟(CSF)。

近年來，PR發生報道數急劇上升，目前該病尚無有效的藥物治療。疫苗接種是預防控制PR的主要措施之一，就目前來看，PR的傳統疫苗已經相對成熟，但現代疫苗的研究尚處于研究階段。因此，提高PR的診斷技術是防控該病的先決條件，只有早發現、早防控才能更加有效地降低PR的發生，避免養豬業遭受巨大的經濟損失。隨著免疫學和分子生物學技術的日漸完善，相關的血清學方法和分子生物學方法也不斷完善。為此，本文對臨床診斷、病原學、血清學及分子生物學等主要方法的研究進展和應用情況進行綜述，以期為PR臨床診斷與檢測技術提供參考和借鑒。

一、臨床診斷

臨床診斷就是根據流行病學特點、典型的臨床癥狀及病例剖檢等初步診斷。感染PR的病豬臨床癥狀因年齡和毒株毒力不同而有所差異。其中哺乳仔豬最為敏感，病死率可達100%，主要臨床表現為高熱、排稀便、嘔吐-共濟失調、四肢呈游泳狀等神經癥狀，最后昏迷死亡；成年豬多數不表現臨床癥狀，或僅出現體溫輕微升高；懷孕母豬常發生流產，產木乃伊胎或死胎。

二、病原學診斷

病原學診斷主要包括三種方法，即病毒分離、病毒接種及動物感染，被稱為診斷PRV的黃金標準，但存在敏感性較差的問題。病毒分離取病死豬或處于發熱期病豬的中腦、腎臟、肝、脾及扁桃體，加PBS制成10%懸液，再加雙抗，混勻，4℃過夜后2 000 r/min離心，取上清待動物感染或細胞接種使用。取處理液接種于PK-15、SK6等敏感細胞，培養24～72 h左右，取培養物進行HE染色，鏡檢可發現酸性核內包涵體；接種于家兔或小白鼠，接種后2～3 d，家兔與小白鼠均出現典型的劇癢癥，體溫升高，接種后 3～5 d全部死亡，即可確診，病毒尚可以在病死兔腦中分離獲得。

三、血清學方法

血清學檢測手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡單、方便，不需要使用昂貴復雜的儀器，已經被廣泛應用。目前常應用血清學方法有瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、中和試驗（NT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和乳膠凝集試驗（LAT）。

1.瓊脂免疫擴散試驗(AGID)。瓊脂免疫擴散試驗（AGID）無需特殊設備，技術操作簡單，結果準確，因此適用于基層獸研單位和大型豬場的現場定性診斷及豬群隱形無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和血清中和實驗(SNT)進行了比較試驗，發現與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等(2002)利用AGID技術對5個豬場進行了抗體檢測，結果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，再一次顯示了AGID技術的簡便和快捷。

2.中和試驗（NT）。中和試驗（NT）又稱微量血清中和試驗（MSNT），是檢測病毒比較經典的方法，是世界上多數國家診斷PR的法定方法之一。NT敏感性及準確性都較理想，但操作繁瑣，且受技術、細胞等條件限制，不適合作為流行病學調查和大批量疫控監測使用。邱德新等應用MSNT和偽狂犬病乳膠凝集實驗(LAT)診斷試劑盒進行了PRV抗體效價測定和相關性分析，結果表明兩種方法檢測結果符合率高，特異性強，LAT比MSNT敏感、快速簡便和實用。孫廣力等應用LA T、AGID、MSNT 3種診斷方法對45份豬血清樣品進行了PR血清杭體檢測，結果表明MSNT的準確性、敏感性、特異性均最為敏感。

3.乳膠凝集試驗（LA T）。乳膠試驗凝集試驗（LAT）是利用抗原和抗體特異性結合的特點，將抗原先用乳膠包被，再與相應血清反應，幾分鐘內即可得出結果，具有操作簡單、方便、快速。與NT相比，LAT具有更加廣闊的推廣前景。羅勇等利用乳膠凝膠實驗技術對疑似豬瘟病的病豬進行了豬偽狂犬病毒的檢測，230份血清中陽性率11%。近年，美國已經有商品化的LAT試劑盒供臨床使用。國內華中農業大學也成功研制了gGLAT和gELAT試劑盒。

4.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為廣泛應用的一種免疫檢測方法，被OIE定為診斷PR的首選血清學方法。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學和酶促生化反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定實驗，具有特異、敏感、快速、簡便的優點，適用于實驗室大批量樣品的檢測、產地檢疫及流行病學調查等。國內蔣玉雯等(1988)建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學調查。隨著基因工程缺失疫苗的研制成功，我國唐勇、羅飛等學者又陸續建立了可以鑒別診斷野毒株和疫苗毒株、敏感性和特異性更高的ELISA方法。

四、分子生物學技術

1.核酸探針。在多種診斷偽狂犬病的方法中，核酸探針技術是近年來迅速發展起來的一種新型分子生物學技術探針技術。它具有特異性良好、敏感程度高的優點，被廣泛用于PRV的診斷和檢測中。Maes等用生物素和地高辛標記的探針從三叉神經節診斷出PRV DNA，并進行了原位雜交，從單細胞的水平上檢出存在的潛伏感染。在國內，郭萬柱等采用32P探針標記PRV全基因組和重組質粒應用斑點雜交技術，能檢測出10pg的PRV DNA，并具有較高的特異性。王琴等、魏偉等相繼以非放射性生物素和光敏生物素標記DNA探針，均能有效地檢測出PRV DNA。2008年，劉志杰等制備了地高辛標記的gE基因核酸探針，對PRV野毒的最低檢出量為4pg，與PCR檢測結果一致，表明該核酸探針可用于PR野毒感染的臨床診斷。

2.PCR方法。（1）常規PCR方法。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）因其快速、特異、敏感、安全可靠等明顯優勢，在檢測PRV方面得到了廣泛應用。目前，PRV檢測的基因片段主要有gB、gD、gG和gE等，其中gD基因是主要中和抗原基因。我國周復春等應用PCR技術進行了PRV的檢測，并對潛伏的感染部位也進行了相應的研究；石建平等對常規PCR法進行了改進，將試驗縮短到 4h 內完成，提高PCR的效率，使PCR技術更趨于實用化；Katz等、劉麗娜等建立的套式PCR和多重PCR能有效區分野毒株和不同疫苗株。近年來，隨著這項技術的不斷進步，檢測PRV與其他豬病病毒的PCR方法也相繼建立，這種多重PCR將成為分子生物學檢測和流行病學調查的常用方法。

（2）實時熒光定量PCR方法。實時熒光定量PCR技術(Real-time Fluo-rescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR)是20世紀90年代中期在PCR定性技術基礎上發展起來的高靈敏度的核酸定量技術，該技術已被廣泛應用于遺傳學、育種學、營養學和醫學等研究領域，應用前景相當廣闊。2009年，趙麗等根據gH、gE基因先后建立了PRV實時定量熒光RCR、鑒別PR野毒與疫苗毒感染的熒光定量PCR兩種方法；呂建強等根據gD基因建立了PRV實時熒光RCR方法，最低檢測限可達1.42 pg/μl的總DNA；Ma W等根據gB、gE基因建立了快速檢測區分PR野毒與基因缺失疫苗毒的實時熒光定量PCR方法，能夠快速、特異地檢測出感染和潛伏感染野豬體內的PRV。

五、展望

我國是世界第一養豬大國，生豬存出欄數及豬肉產量多年來位居世界第一，然而我國養豬業一直受到疫病問題的困擾，PR就是其中主要疫病之一。目前用于診斷PR的檢測方法很多，各有其優缺點。傳統方法可靠，但往往操作較復雜或耗時較長，實際應用中有一定的困難；血清學方法，特別是鑒別ELISA試劑盒的研制成功和廣泛應用，不僅使PR的檢測變得簡便、快速、敏感，還可以鑒別野毒和疫苗毒；分子生物學方法靈敏度高、特異性好，隨著研究的深入和完善將會越來越被廣泛應用。當然，無論哪一種診斷檢測方法都不能徹底解決所有問題，可以根據檢測目的和要求進行選擇和配合應用，以期達到早發現、早解決。同時，還應不斷深入研究，建立更多快速、簡便、實用的檢測診斷方法，以更好的促進該病的綜合防控和疫病凈化工作的開展。

（略）