大氣顆粒物呼吸系統毒性效應機制

趙云利，趙宇欣，何義勝，王元

（蚌埠醫學院公共衛生學院，安徽 蚌埠 233030）

環境污染，已成為影響人類健康的重大環境問題，引起了世界的廣泛關注。顆粒物是大氣污染的主要成分，也是環境污染危害人類健康的重要原因。流行病學調查和毒理學實驗均證實大氣顆粒物可以帶來諸如心血管疾病、呼吸系統疾病等多種健康危害，尤其是與哮喘、肺炎、呼吸道炎癥等呼吸系統疾病的發生高度相關。本文將大氣顆粒物對呼吸系統產生危害的生理生化與分子機制進行了綜述。

1 氧化應激

氧化損傷通常被認為是顆粒物毒性效應的首要原因。當呼吸系統遭受顆粒物的刺激時，呼吸道上皮細胞產生活性氧，細胞內氧化-抗氧化體系失衡，對細胞溶酶體、線粒體等細胞器產生損傷，導致細胞的生理生化及代謝功能障礙，最終導致呼吸系統疾病的產生或加重［1-3］。顆粒物致機體氧化-抗氧化體系失衡包含以下3個主要原因：顆粒物上附著的化學成分使得顆粒物本身具有自由基活性，如冬季燃燒顆粒物中的左旋葡聚糖、半乳聚糖和鉀等成分與其氧化能力緊密相關［4］；顆粒物的刺激致使肺泡上皮細胞產生活性氧，誘導線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅲ產生活性氧［1］；超氧化物歧化酶 SOD1、SOD2、過氧化氫酶（CAT）、過氧化還原酶6（PRDX6）等抗氧化酶活性改變［2］，細胞凋亡信號調節激酶1（ASK1）及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路被激活［1］，機體抗氧化能力及氧化防御功能降低。

顆粒物暴露可以使人肺上皮細胞A549的SOD和CAT活性發生改變［5］，燃燒顆粒物可使大鼠抗氧化酶（SOD1、SOD2、CAT、PRDX6）和核轉錄因子Nrf2的活性明顯上升［2］。PM2.5誘導產生的活性氧可能作為信號分子，通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）激活氧化應激的關鍵信號通路Nrf2來防御氧化應激損傷［6］。PM2.5暴露促使Nrf2從細胞質向核內轉移，誘導AKT磷酸化和NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO-1）、血紅素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）的轉錄表達［6］。但PI3K抑制劑可以顯著下調PM2.5誘導的Nrf2核質轉移及HO-1的轉錄水平［6］。顆粒物可誘導肺泡上皮細胞線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅲ產生活性氧，激活ASK1及JNK信號通路，增加肺泡-毛細血管屏障的通透性［1］。Song等［7］研究發現，miRNA Let-7水平的顯著下調及其靶基因精氨酸酶2（ARG2）的表達上調是支氣管上皮細胞在PM2.5暴露后誘導的氧化損傷和細胞凋亡的內在分子機制。

2 炎癥反應

顆粒物對呼吸道上皮細胞的炎癥刺激反應可能是氧化應激引發的后續級聯反應［8］。顆粒物暴露可促進肺泡及支氣管上皮細胞分泌白細胞介素 IL-6、IL-8、IL-Iβ 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子和細胞因子［9-11］，上調免疫活性因子NF-κB［12］，促進炎癥細胞浸潤從而對呼吸系統產生危害。這些炎癥因子與胞外基質共同調節著顆粒物導致的組織修復和炎癥反應［13］。

氣管滴注顆粒物后大鼠肺組織出現炎癥細胞浸潤和充血，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數量增加；TNF-α、IL-1、IL-1β和細胞間黏附分子1（ICAM-1）等炎癥介質顯著上調，SOD和丙二醛（MDA）含量增加，同時誘導型一氧化氮合酶（NOS2A）、一氧化氮、細胞色素氧化酶、谷胱甘肽S-轉移酶等活性物質的含量也明顯上升［9-11］。松木粉塵暴露還可引起大鼠肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞以及肥大細胞增多［14］。在氣管滴注顆粒物的小鼠中也發現了類似結果：博來霉素誘導的肺纖維化小鼠暴露于PM2.5中可導致肺組織炎性細胞浸潤程度明顯加重，肺泡間隔變寬，肺纖維化明顯加重，肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α水平顯著增高［15］；PM2.5暴露還可導致肺氣道黏膜嗜酸性粒細胞誘導性增強，支氣管上皮杯狀細胞增生，嗜酸性粒細胞相關細胞因子增加，支氣管肺泡灌洗液中趨化因子增加，F4/80（+）CD11b（+）細胞增加，且CD206陽性的F4/80（+）CD11b（+）細胞（M2巨噬細胞）比例增加［16］。Ramanathan 等［17］在 PM2.5暴露的小鼠鼻腔灌洗液中觀察到血清白蛋白含量顯著增加，黏附分子Claudin-1和上皮鈣黏蛋白的表達下降，嗜酸細胞性炎癥因子IL-13和Eotaxin-1的表達上調，嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的明顯積聚。顆粒物暴露可顯著增加小鼠巨噬細胞和支氣管上皮細胞中炎癥因子（IL-1β、IL-8、TGF-β和環氧合酶-2）和氧化應激基因（HO-1）的表達水平［18-19］，還可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑和轉錄因子NF-κB信號通路誘導炎癥反應［12］。

3 免疫反應

顆粒物可對中性粒細胞產生刺激作用，提高機體特異性抗體水平，誘發哮喘等呼吸系統疾病。研究顯示，柴油廢氣顆粒物可降低肺巨噬細胞的存活率，使機體免疫應答水平降低［20］。顆粒物還可以導致機體內CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及自然殺傷（NK）細胞減少，CD4/CD8比例下降，機體抵抗能力降低［21］。長期PM2.5暴露能引起小鼠輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg細胞）及相關細胞因子失衡，免疫功能下降［22］。PM2.5還可激活CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞清除的功能，刺激呼吸系統分泌機體蛋白［23］。

Toll樣受體（TLR）能識別外源化學物，啟動天然免疫，在抗感染中發揮重要作用。大氣顆粒物可以激活TLR2和TLR4信號傳導途徑，并作為NOD樣受體家族炎性小體（NLRP3）的有效激活劑促進炎癥反應的發生［24］。Fuertes等［25］通過出生隊列研究分析揭示PM2.5濃度與過敏性鼻炎顯著相關，攜帶TLR4 rs1927911等位基因的兒童患過敏性鼻炎的風險增加。暴露于PM2.5的小鼠肺泡灌洗液中TLR4和TLR2的表達下調，NF-κB被激活，Th1/Th2偏移，進而驅動Th2型免疫應答，導致炎癥浸潤的產生［26-27］。

4 細胞鈣穩態失衡

顆粒物誘導產生的自由基和炎癥反應可以導致細胞脂質過氧化及胞內Ca2+濃度的增加，而Ca2+濃度的增加又導致更多活性氧的產生，加重機體的氧化應激。顆粒物暴露大鼠肺泡灌洗液中堿性磷酸酶、表面活性物質和上皮標志酶活性增加，細胞膜通透性增加以致Ca2+內流、細胞內Ca2+濃度增加［28］。支氣管上皮細胞的 Ca2+信號可被大氣顆粒物所介導，Ca2+通路抑制劑則可以減弱顆粒物誘導的Ca2+應答［10］。對人肺成纖維細胞的研究也證實，顆粒物可通過磷脂酶阻斷劑、瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）M亞家族成員TRPM2抑制劑等調節細胞膜通透性，改變細胞內Ca2+信號傳導［29］。因此，當給予細胞TRPM2阻滯劑克霉唑（CLZ）與鄰氨基苯甲酸（ACA）時，顆粒物所致細胞氧化應激水平下降，細胞內Ca2+信號衰減［29］。細胞局部Ca2+濃度的增加，還可使細胞內鈣調神經磷酸酶-活化T淋巴細胞核因子基因表達上調，誘發細胞免疫下降與凋亡［30］。

5 遺傳損傷

顆粒物可導致肺泡或支氣管上皮細胞發生DNA損傷，干擾肺組織細胞的核酸修復反應，引起遺傳毒性和細胞凋亡，誘導呼吸系統疾病發生或加重。研究發現顆粒物通過直接作用于修復蛋白抑制DNA修復、降低DNA復制的保真度，提高DNA復制錯誤幾率和突變率［31］，使線粒體DNA拷貝數降低［3］，基因組DNA鏈斷裂［32］，微核增加［33］等途徑引起DNA表達、修復紊亂，最終導致遺傳損傷。彗星實驗分析顯示顆粒物上粘附的多環芳烴（PAH）和羥基類還可以使V79和人淋巴細胞產生移碼突變［34］。Mukherjee等［35］發現長期暴露于烹飪煙霧可以減少家庭主婦呼吸道上皮細胞的DNA錯配修復蛋白（MMR）同源物mutL1（MLH1）和 mutS 2（MSH2）的表達，增加了DNA錯配的可能。

除直接對DNA產生損傷外，顆粒物吸附的物質還可以與DNA結合形成加合物，干擾DNA的正常功能。Rossner等［36］用P32標記的方法對外周血淋巴細胞DNA加合物進行檢測，結果提示空氣重污染地區顆粒物暴露人群的外周血苯并［a］芘（B［a］P）樣DNA加合物的水平均明顯升高。工業區大氣顆粒物可以引起肺泡巨噬細胞產生DNA加合物從而誘導肺癌的產生［37］。柴油機顆粒排放物上吸附的B［a］P和5-甲基青烯（5-MeCHR）等多環芳烴（PAH）能與DNA的親核位點鳥嘌呤外環氨基酸以共價鍵結合形成PAH-DNA加合物，引起DNA損傷［38］。

6 自噬

顆粒物可以被人支氣管上皮細胞所吞噬，被吞噬的顆粒形成自噬內含體進而形成自噬體，誘導自噬的發生。研究發現，隨著顆粒物暴露濃度的增加和時間的延長，A549細胞微管蛋白輕鏈LC3的含量逐漸上升，表明顆粒物可誘導自噬的發生，并且自噬相關基因Atg5和Beclin1的表達明顯上調［5］。Xu 等［39］發現在人支氣管上皮細胞BEAS-2B中，PM2.5暴露可以激活腫瘤蛋白P53，上調其下游靶基因DNA損傷自噬調節因子1（DRAM1）的表達進而誘導自噬的發生，進而激活支氣管上皮細胞中的Src-STAT3通路介導VEGFA上調；此外，PM2.5暴露還可誘導絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATR-CHEK1/CHK1（檢測點激酶1）軸的激活，進一步引發P53依賴性自噬。自噬在顆粒物誘導的炎癥和黏液過度生成中發揮關鍵作用，沉默小鼠自噬相關基因Becn1或Lc3b可以降低顆粒物暴露導致的氣管分泌物的過度產生及炎癥的發生；而溶酶體抑制對自噬流的干擾可導致自噬體與自噬內含體的積累，并加劇IL-8的產生，減弱氣道黏液蛋白（MUC5AC）的表達［40］。

7 表觀遺傳學改變

顆粒物暴露還可以導致甲基化、磷酸化、乙?；缺碛^遺傳學修飾，調節基因表達，影響呼吸系統疾病。顆粒物水平與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者NOS2A的DNA甲基化水平和呼吸道炎癥水平相關［41］。呼出氣一氧化氮（FeNO）是氣道炎癥生物標志物，由氣道細胞產生，其濃度與炎癥細胞數目高度相關；FeNO水平又與NOS2A基因的甲基化水平密切相關［41］。De Prins等［42］以5-甲基-2'-脫氧胞苷的比例衡量人體全血DNA甲基化水平，研究結果提示成人DNA甲基化水平降低與環境PM2.5暴露水平相關。顆粒物暴露還可促進人支氣管上皮細胞中PI3K家族成員中的ATM、CHK2、組蛋白2A變異體（H2AX）磷酸化，導致DNA損傷，使端粒酶活性和miR-21表達上調，芳烴受體（AhR）調節基因（CYP1A1、CYP1B1、AhRR）的表達增加［32，43］。

組蛋白3第27位賴氨酸乙?；℉3K27ac）是參與免疫細胞活化的標記基因，H3K27ac的乙酰化水平與空氣污染引起的免疫和炎癥反應相關，Liu等［44］通過染色質免疫共沉淀與二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術研究發現，顆粒物暴露可以導致H3K27ac的乙?；癄顟B發生變化。組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）是基因轉錄調控的重要調節因子，為炎癥調節相關信號所必需，PM2.5通過激活TGF-β/Smad信號通路誘導WT小鼠的肺功能損傷與炎癥反應；HDAC3缺陷可促進PM2.5誘導的TGF-β/Smad信號通路的激活［27］。

8 基因表達調控

顆粒物暴露可以改變促炎癥反應過程、氧化應激反應以及癌癥和發育途徑中相關基因的表達，共同應對來自外界的刺激。轉錄因子AP-1是細胞內由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體，通過調節基因的表達來應對多種刺激，氣管滴注高濃度顆粒物，大鼠肺組織c-fos和c-jun的表達顯著增高［9］，AP-1 的活性增強［40］。Libalova 等［45］對PM2.5暴露的A549細胞的基因表達分析結果顯示，PM2.5暴露可導致促炎癥反應過程、氧化應激反應以及癌癥和發育途徑中TGF-β和Wnt信號通路等相關基因的表達紊亂，但涉及細胞周期阻滯、DNA修復或細胞凋亡相關的基因表達則沒有發現異常。通過人胚肺成纖維細胞基因芯片分析顯示ABC轉運蛋白（參與外源性和內源性代謝物跨膜轉移和DNA修復），Wnt和TGF-β信號傳導途徑（特別與腫瘤促進和進展相關），類固醇激素生物合成（參與化學物質的內分泌干擾活性）和甘油脂代謝（包括脂質與脂質信號分子的甘油骨架的脂質途徑）相關基因表達明顯失調［46］。

9 細胞周期的改變

顆粒物通過DNA結合、線粒體和紡錘體等的損害引起染色體的過早濃縮，從而導致人類支氣管上皮細胞有絲分裂受阻，細胞增殖受到抑制，并導致細胞凋亡［32］。顆粒物還可以通過長鏈非編碼RNA（lncRNA）LINC0034調節P21蛋白的表達，使支氣管上皮細胞周期阻滯于G2/M期［47］。

此外，顆粒物還可降低機體對其它有害因素的抵抗力。如呼吸道表面的液體含有大量的抗菌蛋白和抗菌肽，而PM2.5與抗菌蛋白和抗菌肽的結合可以減弱其抗菌活性，使機體更容易受到病毒和細菌的侵害［48］。

呼吸系統疾病是大氣顆粒物對人體的主要危害之一，研究證實氧化應激、免疫應答、基因表達與調控等生理生化過程均參與對顆粒物的防御過程［49］。深入了解顆粒物對機體呼吸系統損傷的機制有助于我們預防顆粒物產生的呼吸系統危害，探索防治大氣顆粒物危害的有效方法和技術。