蒙藥德都紅花-7味散及優(yōu)化方對酒精性脂肪肝大鼠肝組織Toll樣受體、核因子-κB、轉(zhuǎn)化生長因子-β1蛋白表達的影響

巴圖德力根 洪金鳳 安 達 韓志強 徐艷華 娜日蘇

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥臨床藥理研究所,內(nèi)蒙古 通遼 028007)

蒙藥德都紅花-7味散為蒙醫(yī)治療肝病的主要制劑之一，記載于蒙醫(yī)經(jīng)典名著《四部醫(yī)典》〔1〕，具有解毒、清肝血熱、調(diào)理體素、祛黃之功效，臨床主要用于新舊肝病、肝腫大、肝損傷、肝血增盛、目及皮膚發(fā)黃。德都紅花-7味散及優(yōu)化方治療酒精性和高質(zhì)飲食致大鼠脂肪肝療效確切〔2,3〕。本研究探討蒙藥德都紅花-7味散及優(yōu)化方對酒精性脂肪肝大鼠肝組織Toll樣受體(TLR)4、核因子(NF)-κB、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料及實驗動物 清潔級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量140～160 g，長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號：SXXK(吉)2011-0004。藥物與試劑：德都紅花-7味散、德都紅花-7味散優(yōu)化方，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑部制備。NF-κB抗體、TLR4、TGF-β1抗體,批號：201507,均購自北京博奧森生物有限公司。儀器設(shè)備：LEICAEG1150H組織石蠟包埋機，LEICARM2235冷凍切片機DM2500顯微鏡，德國萊卡。

1.2方法 大鼠隨機分為4組，即空白組、模型組、德都紅花-7味散原藥組、德都紅花-7味散優(yōu)化方組，每組各10只，空白組灌胃蒸餾水，其他組每天灌胃40°白酒15 ml/kg，連續(xù)灌胃16 w。空白組普通飼料，其他組給予高脂飼料(普通飼料∶豬油=85∶15，每1 000 g飼料中加入15 g硫酸亞鐵)〔4〕。德都紅花-7味散原藥組、德都紅花-7味散優(yōu)化方組均按0.6 g/kg灌胃給藥,1次/d，連續(xù)給藥16 w，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉，腹腔靜脈取血處死。取肝左葉組織10%中性甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸石蠟、包埋、制作石蠟切片、切片5 μm，免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。陽性表達部位是細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍色，其中TLR4主要表達見于細(xì)胞質(zhì)，少見細(xì)胞核亦有表達。NF-κB細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達。TGF-β1主要表達見于細(xì)胞質(zhì)，少見細(xì)胞核亦有表達。染色結(jié)果采用Motic Images Advanced3.2圖像分析儀分析，測定灰度值，灰度值越高陽性表達越低(因灰度值代表陰性著色部位)，灰度值越低陽性表達越高。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

模型組TLR4、NF-κB、TGF-β1灰度值較空白組顯著降低(P<0.01)；德都紅花-7味散原藥組和優(yōu)化組TLR4、NF-κB、TGF-β1灰度值較模型組顯著升高(P<0.01)；德都紅花-7味散優(yōu)化組TLR4、NF-κB灰度值較原藥組顯著升高(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 各組肝組織免疫組化法檢測TLR4、NF-κB、TGF-β1蛋白表達灰度值比較

與空白組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與德都紅花-7味散原藥組比較:3)P<0.05

圖1 各組肝組織TLR4、NF-κB、TGF-β1蛋白表達(免疫組織化學(xué)，×200)

3 討 論

酒精性脂肪肝是酒精性肝病中最常見的病理和臨床類型之一〔5〕。大量乙醇攝入導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過氧化增加，肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。同時，大量乙醇進入機體后，被進一步脫氫氧化為乙醛和乙酸鹽，使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，乙醛又能和細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)如蛋白結(jié)合反應(yīng)形成復(fù)合物，導(dǎo)致肝細(xì)胞空泡變性〔6〕。酒精中毒能使腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加，也可激活NF-κB〔7〕， NF-κB是一種核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中重要的調(diào)控因子，能與多種基因啟動子部位的κB點發(fā)生特異性結(jié)合，是促進轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白的總稱。同時又可以被多種細(xì)胞因子或外界刺激激活，調(diào)節(jié)下游多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)過程。NF-κB是應(yīng)激與炎性反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)物〔8〕。TLR4與內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)引細(xì)胞因子釋放，引起肝細(xì)胞損害及炎癥反應(yīng)〔9〕，這些因子可以激活Kupffer細(xì)胞上的NF-κB，活化后的NF-κB可以通過p38和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，最終使得肝細(xì)胞凋亡〔10〕。TGF-β1屬于轉(zhuǎn)化生長因子，在肝臟中含量最高且具有生物活性，具有自分泌和旁分泌功能，對細(xì)胞外基質(zhì)的代謝與功能有重要的調(diào)節(jié)作用，它是促進肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要刺激因子，與肝纖維化息息相關(guān)。TGF-β1可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)促進肝損傷組織修復(fù)〔11〕。德都紅花-7味散優(yōu)化方是在原德都紅花-7味散基礎(chǔ)上，加祛巴達干，調(diào)節(jié)體素和治療巴達干包如病蒙藥材組成。本研究結(jié)果表明德都紅花-7味散原藥和優(yōu)化方能夠抑制TLR4、NF-κB、TGF-β1的陽性表達；優(yōu)化方作用優(yōu)于原藥。德都紅花-7味散及優(yōu)化方可能是通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路和TGF-β1分泌起到防治酒精性脂肪肝的作用。

1巴根那.蒙醫(yī)方劑學(xué)〔M〕.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2007:212.

2洪金鳳,巴圖德力根,韓志強,等.德都紅花-7味散對酒精性脂肪肝的預(yù)防和治療作用〔J〕.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015；30(3):259-63.

3巴圖德力根,張 偉,韓志強,等.蒙藥德都紅花-7味散對高脂飲食誘導(dǎo)實驗性脂肪肝大鼠血脂四項和SOD、MDA的影響〔J〕.世界華人消化雜志,2015；23(31):5011-6.

4江國榮，張露蓉，嚴(yán) 煒，等.保肝湯對酒精性脂肪肝預(yù)防和治療作用的實驗研究〔J〕.安徽醫(yī)藥，2010；14(1)：25.

5古寧艷，楊少軍，王 歡.慈姑消脂丸對酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及肝臟形態(tài)學(xué)的影響〔J〕.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013；14(1)：21.

6張玉華，焦栓林，秦建增，等.殼脂膠囊聯(lián)合復(fù)方甘草酸治療酒精性脂肪肝療效觀察〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2013；23(1)：27.

7梁 衛(wèi),梁 濤,張麗玲,等.解酒消脂湯對酒精性脂肪肝保護作用的實驗研究〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志,2014；30(6):534-6，549.

8金武丕，車秀云，韓光石，等.急性酒精中毒致肝臟損傷42例臨床分析〔J〕.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，1997；20(4)：234-5.

9Enomoto N,Takei Y,Yamashina S,etal.Anti-inflammatory strategies in Alcoholic steatohepatitis 〔J〕.Gastroenterol Hepatol,2007;22(Suppl 1):559.

10Hirano F,Komura KJ,Fukawa E,etal.Tumor necrosis factora(TNF-α)-induced RANTES chemokine expression via activation of NF-κB and p38 MAP Kinase:roles of TNF-α in alcoholic liver disease〔J〕.J Hepatol,2003;38(4):483-9.

11Tsukada S,Parsons CJ,Rippe RA.Mechanisma of liver fibrosis〔J〕.Chim Acta,2006;364(1):33-60.