山雞主要疫病免疫與抗體消漲規律的研究

衛龍興 ，袁紅艷 ，戴連群 ，張春華 ，方桂明 ，焦 楠

（1.上海市奉賢區動物疫病預防控制中心 201400；2.上海欣灝珍禽育種有限公司 201403）

前言

山雞，俗稱野雞、學名雉，是一種在我國廣泛分布的小型鳥類，其外貌絢麗多彩、肉質細嫩鮮美、野味濃郁醇厚、營養豐富齊全，具有較高的經濟和觀賞價值；近年來，隨著社會發展和物質生活水平的不斷提高，人們對名特優新產品的需求也不斷增長，而山雞作為其中的典型代表，成為了人們的首選，市場需求與日俱增，人工養殖的規模和數量逐年上升；據不完全統計，目前國內存欄商品種山雞約200萬套，年上市商品肉山雞近億羽、商品山雞蛋約5億枚，成為特種養殖中規模最大的品種。

山雞的抗病能力較強，野生環境下幾乎無疾病發生。但山雞的規模化人工養殖，在有效緩解市場需求和生態保護壓力的同時，高密度人工飼養也加速了山雞抗病能力的退化，顯著增加了各類疫病的發生概率，特別是高致病性禽流感（HPAI）、雞新城疫（ND）、雞傳染性支氣管炎（IB）、H9N2 亞型禽流感（MPAI）、雞傳染性法氏囊（IBD）等主要疫病，已嚴重危害了產業的發展。而目前國內還沒有一套專門用于山雞的各類主要疫病的免疫程序，也未見系統開展山雞各類主要疫病免疫及抗體消漲規律研究的報導，養殖戶基本都是參照家禽的推薦免疫程序進行免疫，免疫失敗現象時有發生。為此，作者根據多年從事山雞養殖和疾病防控的經驗，經過精心設計和組織準備，開展了一輪針對山雞HPAI等主要疫病的全周期免疫效價評估試驗，相關結果如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗山雞

某大型山雞養殖場1日齡祖代種山雞雛苗1萬羽，上海欣灝珍禽育種有限公司2016年7月2日出雛；孵化過程嚴格按照種蛋孵化流程操作。試驗山雞入孵種蛋為43周齡健康種山雞所產，其在整個飼養期已按照蛋雞免疫程序分別實施了各類主要疫病的規范免疫。

1.1.2 免疫疫苗

各主要疫病免疫疫苗見表1。

表1 試驗山雞各主要疫病免疫疫苗匯總表

1.1.3 檢測試劑

1.1.3.1 HPAI、ND、MPAI等主要疫病HI檢測試劑見表2。

表2 試驗山雞HPAI、ND、MPAI等疫病HI檢測試劑匯總表

1.1.3.2 IB、IBD等主要疫病ELISA檢測試劑見表3。

表3 試驗山雞IB、IBD等ELISA檢測試劑匯總表

1.2 方法

1.2.1 試驗山雞飼養

試驗山雞飼養階段與飼養方式見表4。

表4 試驗山雞各飼養階段及方式匯總表

1.2.2 試驗山雞免疫

對試驗山雞全周期（56 周）實施 HPAI、ND、IB、MPAI和 IBD等主要疫病免疫，免疫程序詳見表5。

1.2.3 采樣與樣品處理

采樣批次、日齡和樣品數量見表6。

樣品處理與保存

整個試驗期共采集試驗山雞14個批次、280份血液樣品和43周齡親本母山雞1個批次、20份血液樣品，總數為15個批次、300份血液樣品。

表5 試驗山雞主要疫病免疫程序表

表6 飼養山雞各階段采樣數量匯總表

每個批次樣品在采集后立即分離血清，標記后冷凍保存；至全部15個批次血樣全部采集完成后集中檢測。

1.2.4 檢測與判定

各主要疫病抗體檢測方法與評定標準見表7。

表7 試驗山雞各主要疫病抗體檢測方法與評定標準匯總表

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 親本母山雞20份血樣各主要疫病免疫抗體檢測結果

2.1.1.1 HPAI、ND、MPAI等主要疫病HI抗體檢測結果見表8。

表8 HPAI、ND、MPAI等三種疫病HI抗體檢測結果匯總表

2.1.1.2 IB、IBD等主要疫病ELISA抗體檢測結果見表9。

表9 IB、IBD等二種疫病ELISA抗體檢測結果匯總表

2.1.2 試驗山雞14個批次樣品各主要疫病抗體檢測結果

2.1.2.1 H5N1 HPAI抗體檢測結果

①各批次樣品HI檢測H5N1 HPAI抗體均值與合格率見表10。

表10 各批次樣品HI檢測H5N1 HPAI抗體均值與合格率匯總表

②各批次樣品HI檢測抗體均值變化情況見圖1。

③各批次樣品HI檢測抗體陽性合格變化情況見圖2。

2.1.2.2 ND抗體檢測結果

①各批次樣品HI檢測ND抗體均值見表11。

②各批次樣品HI檢測ND抗體均值變化情況見圖3。

③各批次樣品HI檢測ND抗體陽性合格變化情況見圖4。

圖1 各批次樣品HI檢測HPAI抗體均值折線圖

圖2 各批次樣品HI檢測抗體陽性合格率折線圖

表11 HI檢測ND抗體均值和陽性合格率匯總表

圖3 各批次樣品HI檢測ND抗體均值變化情況折線圖

圖4 14個批次樣品HI檢測ND抗體陽性合格率折線圖

2.1.2.3 IB抗體檢測結果

①各批次樣品ELISA檢測IB抗體OD均值及陽性合格率見表12。

②各批次樣品ELISA檢測IB抗體OD均值變動情況見圖5。

③各批次樣品ELISA檢測IB抗體陽性合格率變動情況見圖6。

2.1.2.4 H9N2 MPAI抗體檢測結果

①H9N2 MPAI抗體HI檢測均值與陽性合格率見表13。

②H9N2 MPAI抗體HI均值變動情況見圖7。

③H9N2 MPAI抗體合格率變動情況見圖8。

表12 各批次樣品ELISA檢測IB抗體OD均值及陽性合格率匯總表

圖5 各批次樣品ELISA檢測IB抗體OD均值折線圖

圖6 各批次樣品ELISA檢測IB抗體陽性合格率折線圖

表13 14個批次樣品H9N2 MPAI HI抗體HI均值與陽性合格率匯總表

圖7 14個批次樣品H9N2 MPAI抗體HI檢測均值折線圖

2.1.2.5 IBD抗體檢測結果

①各批次樣品ELIS檢測IBD抗體OD均值與陽性合格結果見表14。

②各批次樣品ELISA檢測IBD抗體OD均值變動情況見圖9。

③各批次樣品ELISA檢測IBD抗體合格率變動情況見圖10。

2.2 分析

2.2.1 種母山雞免疫抗體分析

2.2.1.1 HPAI免疫抗體

分析表8可見，43周齡種母山雞的20份血樣中，Re-6株的抗體陽性率達到了100%，且HI平均值達6.85 1og2，遠高于4 1og2的合格標準；Re-8株的抗體陽性率為95%，雖然有1份樣品的HI值為0，但群體HI平均值仍達到4.7 1og2，超過了4 1og2的合格標準。

圖8 14個批次樣品HI檢測H9N2 MPAI抗體陽性合格率折線圖

表14 ELISA檢測IBD抗體OD均值與陽性合格結果匯總表

圖9 各批次樣品ELISA檢測IBD抗體OD均值變動曲線圖

圖10 各批次樣品ELISA檢測IBD抗體陽性合格率變化曲線

結論：種母山雞H5N1 HPAI免疫抗體尚可。

2.2.1.2 ND免疫抗體

從表8可以看到，20份樣品全部合格，且HI均值達到8.6 1og2的高水平。

結論：親本母山雞在留取種蛋時的ND免疫抗體良好。

2.2.1.3 IB免疫抗體

分析表9可以看到，親本母山雞在留用種蛋時，其IB的免疫抗體達到了較高的水平，20份樣品的OD均值達到了0.497，超過0.0923的臨界值達0.4047。

結論：種山雞IB免疫抗體良好。

2.2.1.4 H9N2 MPAI免疫抗體

分析表8：種母山雞20份血樣的HI值全部合格，平均值達9.0 1og2。

結論：種母山雞的H9N2 MPAI免疫抗體水平較高，可有效抵御野毒侵襲。

2.2.1.5 IBD免疫抗體

從表9可以看到，親本母山雞IBD免疫抗體總體良好，基本呈正態分布，唯一一份不合格樣品的OD值也與臨界值較接近，大部分樣品OD值界于臨界值與全部樣品均值之間，另有3份樣品的OD值超過了檢測試驗標陽OD值。

結論：種山雞IBD免疫抗體良好。

2.2.2 試驗山雞抗體檢測結果分析

2.2.2.1 H5N1 HPAI抗體檢測結果

①母源抗體

分析表10和圖1、圖2發現，由于種母山雞的免疫抗體水平較高，初生（0日齡）雛雞均獲得了較高的母源抗體，Re-6株和Re-8株的抗體陽性率分別達到100%和95%，與種母山雞的抗體合格率相當，而且HI平均值也與種母山雞的HI平均值較接近。但雛山雞母源抗體的消失速度較快，10日齡后Re-6株和Re-8株的母源抗體HI平均值均低于4 1og2的合格標準，而且群體的陽性合格率也低于了70%的群體合格標準，說明此時的試驗雞群已處于高危時期，應予免疫。

由于山雞的個體較小，目前養殖戶采用的傳統免疫程序均為33日齡左右首免；因此從表10中可以看到，30日齡時Re-6株的母源抗體幾乎為0，圖1中可直觀見到Re-6株 30日齡的抗體HI值已下降至0；而Re-8株則在10日齡達到低谷后，在20日齡和30日齡2個批次的樣品檢測中，抗體HI值呈現了一個逐步上升的現象，但此時試驗雞群未曾開展相關免疫、亦未見任何異常，這一現象有待作進一步探討。

②免疫抗體

從表10中還可看到，試驗山雞群33日齡實施首免后，Re-6株的免疫抗體HI值快速上升至8.9 1og2，在強化免疫后持續上升至9.3 1og2，達到第一個高峰值，群體陽性合格率達到100%，但這一較高的HI均值僅維持一個月左右即呈現快速下降，2個月后（180日齡）的HI值已跌至1.75 1og2的低值，且群體合格率也僅為30%，明顯低于70%的合格標準。

Re-8株的表現則有所不同，其在首免后的免疫抗體快速上升，并在60日齡時也達到了第一個高峰值，且HI均值達到了10.35 1og2，遠高于Re-6株的8.9 1og2，群體陽性合格率也先于Re-6株達到100%。以后Re-8株的抗體水平逐漸穩步下降，即使是69日齡加強免疫也未見抗體HI值有明顯的變化，但HI均值下降的速度較慢，4個月后（180日齡）仍保持在合格標準以上（HI均值為 4.95 1og2）。

開產前進行第二次加強免疫后，Re-6株和Re-8株的HI均值分別達到了11.45和11.6的高峰值 （實驗室檢測的最高值為12 1og2），隨后免疫抗體穩定且緩慢下降，直至淘汰仍保持較高水平。

③小結

雛山雞Re-6和Re-8兩毒株的母源抗體水平較高，但消退較快。

33日齡首免后，兩毒株抗體均快速上升；二免后Re-6株抗體有一個小幅的提升，但Re-8株則對二免無明顯反應。三免后，兩毒株的抗體水平呈現了穩定的同步上升和消退趨勢，且持續保持較高抗體水平，直至淘汰。

2.2.2.2 ND抗體檢測結果分析

①母源抗體

從表11和圖3、圖4中可以發現，雛山雞ND母源抗體水平較高、但消退速度較快，至20日齡時的HI均值僅為4.2 1og2，已低于了5 1og2的合格標準；而且陽性合格率也降低至50%，低于70%的群體合格標準。從圖1中可以更直觀地看到母源抗體HI均值有一個平穩且較快速消退的陰性曲線；圖2中的陽性合格率曲線也印證了這一現象。

提示：ND母源抗體水平較高、但消退速度較快，應在10日齡左右對雛山雞進行一次ND有效免疫。

②免疫抗體

結合試驗山雞免疫程序，分析表11和圖3、圖4可見，試驗山雞在9日齡和12日齡時采用噴霧和滴鼻的方式分別進行了新支H120二聯弱毒疫苗的免疫后，該階段的ND抗體HI均值仍呈現穩定下降現象，未見抗體反彈上升的趨勢，說明這2次免疫未對試驗山雞產生免疫作用。

33日齡肌肉注射新支流三聯滅活疫苗產生了較強的免疫反應，試驗雞群ND免疫抗體的HI均值快速上升至9.95 1og2的高水平，且樣品陽性合格率達到100%；69日齡采用新支流三聯滅活疫苗加強免疫后，HI均值在8.35 1og2以上的高位持續了4個多月的時間，且均衡穩定，樣品陽性合格率也持續保持100%；194日齡加強免疫新支流三聯滅活疫苗后，210日齡檢測的免疫抗體HI均值在原高位又上升了2.5個滴度，達到了10.85 1og2的高水平，并在240日齡時進一步提高至本次試驗的最高峰11 1og2。

后期在240日齡時對試驗山雞采用新支H52二聯弱毒疫苗進行了一次飲水免疫，但表11的HI均值在此階段呈現穩定下降趨勢，說明這次飲水免疫未產生較強的免疫作用。但在330日齡試驗山雞即將淘汰時，在未采取任何免疫措施的情況下，免疫抗體HI均值有一個較強的反彈，圖1的曲線可更直觀地看到這一反彈現象；但記錄顯示此時雞群未見異常，提示此期試驗山雞可能遭到了ND野毒侵襲，由于雞群免疫抗體水平較高而使雞群得到了有效保護。

提示：三次滅活疫苗肌肉注射免疫均起到了較好的作用；但后期弱毒疫苗免疫效果不理想。

2.2.2.3 IB抗體檢測結果分析

①母源抗體

從表12可以看到，0日齡雛山雞的母源抗體OD均值僅為0.098，且樣品合格率僅為40%，提示雛山雞未能較好地繼承親本母山雞的母源抗體，而且母源抗體隨著日齡增長而快速消退，至20日齡時，母源抗體已基本消失殆盡。

提示：試驗山雞在早期未能得到IB母源抗體的保護，應給予有效免疫。

②免疫抗體

試驗山雞按原免疫程序于9日齡和12日齡時分別采用噴霧和滴鼻的方式進行了2次新支H120二聯弱毒疫苗的免疫，但從表12和圖5、圖6可以看到，二次免疫后的OD均值均未見明顯的提高。

25日齡注射新支流三聯滅活疫苗后，IB抗體開始回升，但速度較慢；49日齡第二次注射新支流三聯滅活疫苗后，抗體持續緩慢回升，90日齡和120日齡的OD均值分別為0.228和0.243，但在150日齡時的OD均值有一個突然快速上揚的過程，且1.035的OD均值成為了本次試驗的最高值，比前次測定0.243的OD均值上漲了4倍多，而此階段未進行過任何免疫，故疑似試驗雞群受到IB野毒侵襲，但記錄顯示雞群無異常表現，說明雞群的免疫抗體有效抵御了本次野毒的侵襲。以后幾個批次樣品的OD均值緩慢下降，但仍維持在0.335以上的較高水平，而同期樣品的群體陽性合格率也持續維持在95%以上較高水平。

240日齡采用新支H52二聯弱毒疫苗飲水免疫后，270日齡的OD均值上升了0.156，達到了0.491的高值，這一結果與親本母山雞的抗體水平基本相符。

提示：IB弱毒疫苗早期噴霧、滴鼻免疫作用較小、效果較差；滅活疫苗的注射可起到較好的免疫作用；后期采用中等毒力疫苗飲水免疫可有效提升群體免疫抗體水平。

2.2.2.4 H9N2 MPAI抗體檢測結果分析

①母源抗體

分析表 13和圖 7、圖 8可以看到：0日齡樣品的H9N2 MPAI抗體檢測HI均值高達8.45 1og2，且在隨后的 10、20、30日齡等三批樣品的母源抗體也一直維持在6 1og2以上的較高抗體水平。

提示：H9N2 MPAI的母源抗體良好，且維持時間較長。

②免疫抗體

表13和圖7顯示：33日齡采用H9亞型滅活疫苗首免后，抗體快速提升至12 1og2，并隨著69日齡和125日齡的二次加強免疫，試驗山雞的抗體水平持續升高，并在150日齡時達到14.25 1og2的高峰值，且維持時間較長，在240日齡時的抗體HI均值仍達到10.25 1og2。

在270日齡時，試驗山雞的免疫抗體有一個異常反彈，HI均值高達13.55 1og2，比上一批次樣品的HI均值提高了3.3個數量級，而此期試驗山雞未開展任何相關免疫，也未見任何異常。

提示：試驗山雞可能受到H9N2 MPAI的野毒侵襲，但由于群體免疫抗體的高水平有效保護試驗山雞免受損害。

③抗體陽性合格率

分析表13發現，在本次試驗山雞14個批次280份樣品的H9N2 MPAI抗體HI檢測結果中，僅有3份樣品的抗體水平為陰性，其他均為陽性合格樣品，陽性合格率達到了98.8%。其中3份不合格樣品均在育雛期，分別是10日齡批次2份、30日齡批次1份，這是母源抗體消退后的正常現象。

在33日齡首免后，所有樣品均達到陽性合格標準，且抗體水平遠超5 1og2的臨界值。從圖8我們也可以看到，在10日齡和30日齡有兩個較小的低谷值外，整個試驗期其他批次的抗體陽性合格率均為100%的高峰值。

提示：試驗山雞較好地獲得了親本的母源抗體且維持時間較長；滅活疫苗的免疫效果良好。

2.2.2.5 IBD抗體檢測結果分析

①母源抗體

分析表14和圖9、圖10可以發現，0日齡20份樣品的OD均值為0.06，陽性合格率僅為15%。

提示：IBD母源抗體的遺傳性較差，親本母山雞較高的母源抗體未能較好地傳給子代。

②免疫抗體

在全部14個批次280份樣品的檢測結果中，120日齡前7個批次樣品的OD均值均為0.06左右，而OD臨界值在0.08左右，抗體水平較低；期間雖經IBD中等毒力弱毒疫苗于19日齡和26日齡二次飲水免疫，但IBD免疫抗體未獲提高。

125日齡采用IBD滅活疫苗肌注免疫后，免疫抗體OD均值快速上升，150日齡批次樣品檢測結果達到0.136，180日齡批次繼續上升至0.185，但抗體上升期較短，在210日齡時又快速下降至0.122，240日齡時的OD均值已消退到0.095，接近OD臨界值。最后3個批次樣品的OD均值又出現了一輪強勁反彈，但期間未進行任何相關的免疫措施，提示試驗雞群在此階段可能感染了IBD病毒。

提示：IBD弱毒疫苗飲水免疫的效果較差；滅活疫苗肌注免疫有較好的免疫作用，但抗體有效維持期僅四個月左右。

③抗體陽性合格情況

分析表14和圖10可見，試驗雞群IBD免疫抗體陽性合格率有2個明顯的變化區間，一個是在120日齡以前的低水平區間，另一個是在150日齡后的高水平區間，而125日齡的免疫是兩個區間的拐點。

在低水平區間7個批次樣品中，陽性合格率最高的僅為25%，最低為0。雖然二次飲水免疫也未見效，抗體檢測OD均值無明顯提高；在高水平區間，又可分為兩個高峰階段，第一個高峰段是125日齡免疫后，抗體快速上升并維持3個月后的消退階段，此階段抗體陽性合格率最高值達到了80%；第二個高峰段是本次試驗的最后三個批次樣品，在滅活疫苗抗體逐步消退至臨界值后，可能是受到IBD野毒感染，試驗雞群的抗體陽性合格率出現了一波強勢反彈，高峰值達到了90%，這一變動現象與IBD抗體OD均值的變動情況相符。

3 討論

3.1 關于HPAI

3.1.1 試驗證明：試驗山雞雖從種蛋中獲得了較高的母源抗體，但維持時間較短，10日齡時其殘留母源抗體已不能有效保護雞群，建議在10日齡之前實施首免。

3.1.2 重組禽流感H5N1雙價滅活疫苗 （Re-6株+Re-8株）對山雞有較好的免疫作用，兩毒株均表現了良好的免疫反應。

3.1.3 種母山雞二免后的免疫抗體達到較高水平，但維持時間不足90天；經過三次強制免疫后，較高的免疫抗體可有效保護雞群5個月以上，直至淘汰。建議在150日齡左右實施第三次免疫。

3.2 關于ND+IB

3.2.1 試驗結果證明：在親本母山雞獲得較好免疫的基礎上，ND母源抗體可較好地遺傳給子代，且維持時間較長；而IB母源抗體的遺傳性較差，且母源抗體的消退速度也較快。

3.2.2 育雛期采用噴霧、滴鼻等方式免疫新支H120二聯疫苗的效果較差；三聯滅活疫苗的免疫作用較明顯，特別是ND抗體，可快速將HI均值提高至最高峰，而IB抗體雖然上升較慢，但二次免疫后即可達到較高水平，而且抗體消退也較慢；后期采用新支（H52）二聯弱毒疫苗飲水免疫，對提高IB免疫抗體有較好的作用。

3.3 H9N2 MHAI

3.3.1 試驗結果證明：親本種山雞的高抗體可較好地遺傳給子代。

3.3.2 滅活疫苗具有較好的免疫源性，注射免疫后的抗體上升快、效價高、維持時間長。

3.3.3 根據本次試驗的相關結果，建議在生產實踐中，可適當延后H9N2 MHAI滅活疫苗的首免時間，并減少一次加強免疫。

3.4 關于IBD

3.4.1 試驗結果證明：子代未能通過種蛋獲得種母山雞的高水平母源抗體，而且在育雛期二次使用D78中毒活疫苗進行飲水免疫后，未能有效提升試驗山雞早期免疫抗體。

3.4.2 使用滅活疫苗進行肌注免疫后，IBD免疫抗體快速提升至較高水平，且有效維持三個月以上，可能是活疫苗飲水的基礎免疫起到一定的協同作用。

3.4.3 資料顯示：低毒力株弱毒疫苗主要用于無母源抗體或低母源抗體的雞群；中毒活疫苗主要是供有母源抗體的雞群使用；滅活疫苗主要是供種雞群使用。

3.5 關于山雞免疫程序

根據試驗結果和山雞生理特性，推薦山雞各主要疫病免疫程序見表15。

表15 山雞各主要疫病免疫程序推薦表