大腸桿菌的革蘭氏染色四步法與三步法的比較和分析

張楚晗，宋佳誠，馮書風，田 青

（河北農業大學動物醫學院 071001）

1 大腸桿菌的危害

大腸桿菌能引起動物的腹瀉，主要表現仔豬黃痢、白痢、腸毒血癥、腸炎和豬水腫病等多種臨床癥狀[3]。還易引發不同品種、日齡雞的急性敗血癥、肝周炎等多種癥狀，難于治愈、極易復發，給畜牧業帶來嚴重損失，所以快速鑒別大腸桿菌在日常生產中具有重要的意義。

2 革蘭氏染色法

革蘭氏染色(Gramstain)是細菌學中最基本，最重要的鑒別染色技術，微生物學家Gram氏于1884年發明了著名革蘭氏染色法后，100多年來一直使用著Gram氏發明的四步法，是各細菌實驗室經常使用而不可缺少的細菌檢驗技術之一[1]。檢驗原理是通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁厚、肽聚糖網層次多且交聯致密、不含類脂，故遇乙醇脫色處理時網孔縮小，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色[2]。而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、肽聚糖層較薄且交聯度差、外膜層類脂含量高，乙醇處理時以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

3 材料與方法

3.1 染色劑

革蘭氏染色液（購自濰坊漢唐生物工程有限公司）。

3.2 菌種

培養16h的大腸桿菌。

3.3 革蘭氏染色四步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革蘭結晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸餾水沖洗后干燥。再加上革蘭碘液，作用90s后蒸餾水沖洗，并倒掉多余的水后干燥。之后使用革蘭酒精脫色液脫色，通常30s（視涂片的厚薄而定）后，蒸餾水沖洗后干燥，需注意勿過度脫色，將會導致錯誤的結果[5]。然后以革蘭沙黃復染液復染30s，再以蒸餾水沖洗，干燥后置油鏡下觀察。經此方法染色，保留革蘭結晶紫染液的細菌為革蘭氏陽性菌，初染液被洗脫而使細菌染上沙黃等復染液的顏色為革蘭氏陰性菌。

3.4 革蘭氏染色三步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革蘭結晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸餾水沖洗后干燥。再加上革蘭碘液，作用90s后蒸餾水沖洗，并倒掉多余的水后干燥。之后把革蘭氏染色中的第三步脫色和第四步復染合并一步 ，把兩步的試劑按照1：1的比例混合均勻，作用30s后蒸餾水沖洗并干燥。這樣就可以達到脫色和復染的雙重目的，效果良好[4]。

4 結果與分析

表1 大腸桿菌的革蘭氏染色四步法與三步法的結果

由表1可以看出，采用四步法的有122次合格，成功率為85.0%，三步法的有137次合格，成功率為97.9%，可得三步法成功率比四步法成功率高12.9%，制片時間比四步法平均快3min。染色結果的可靠性一方面因革蘭氏染色的四步法關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，另一方面取決于被檢細菌的狀態，新培養的細菌能保持它本身應有的染色性。用傳統的革蘭氏染色四步法，雖然容易接受但第三步乙醇脫色時間不好掌握，而且所需染色時間較長[6]。革蘭氏染色三步法不但染色結果穩定，而且減少了操作步驟，縮短了實驗時間，提高了成功率。通過改良的革蘭氏三步法以期為獸醫工作者提供參考，合理安排時間，提高效率。建議在實際操作中，工作人員應探索總結影響試驗結果的各種因素，以保障試驗結果準確性。